雷惊雨足草木柔——CGT时代的细胞培养表面处理技术创新沉思录-中

 （前续：CGT时代的细胞培养表面处理技术创新沉思录-上）

二、等离子体表面处理工艺对细胞培养表面性能均一性与稳定性的影响

       等离子体表面改性过程中，不同等离子体反应器配置、工作气体气压与流量、工作电压与放电功率、处理时间等参数设置不同，表面处理效果存在差异。即便是相同类型等离子体反应中，因基材温度、放电功率、气体纯度、流量与反应室气压等控制条件改变，会造成等离子体表面修饰后材料表面水接触角、表面自由能和种类及含量的变化 ^[24] 。

       低温等离子体的粒子能量可高达数十eV，足以打断有机聚合物大分子的C-H和C-C键而形成新键。材料表面发生多种物理、化学性能变化，或产生刻蚀而粗糙，或形成致密的交联层，或引入含氧极性基团。升高等离子体源电压，表面发生化学变化的同时往往伴随表面形貌粗糙化 [7] 。PS经氧气微波等离子体处理30秒、60秒和180秒后，在180秒时材料表面呈现更高粗糙度 ^[18] 。可见，不同处理工艺条件下，材料表面发生各种表面过程是复杂的。

       等离子体处理效应具有显著气体依赖性。空气、CO2射频辉光放电等离子体对PS材料改性后，样品表面氧含量相差悬殊（13.65% VS 21.57%） ^[26] 。氮气处理在降低接触角、含氮官能团（-NH2、-NO2）形成的同时，还使材料表面结构平均粗糙度提升22%。而氧气处理则更利于含氧官能团的定向沉积，聚合物的润湿性通常优于无氧聚合物 ^[22] 。

       不同厂商PSM处理的工艺参数，属于商业技术机密，难以从公开资料获得。但PSM工艺差异，决定了不同厂商培养表面产品工作实际性能存在着差异。Corning的产品应用报告中，不同PSM工艺处理后材料的细胞粘附增殖表现差异已有清晰描述。这种改性处理效果的差异，难以通过动态接触角（DCA）、衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）、化学分析用电子能谱（electron spectroscopy for chemical analysis，ESCA）仪或称为X射线光电子能谱（XPS）快速测定来准确表征，原因在于活性基团的种类与含量、表面接触角大小与不同类型细胞的可粘附性和粘附后增殖活力之间，并无线性量化对应关系。培养表面改性后性能只能通过接种多种类型细胞、经过一定时间培养后的结果来呈现和验证。这是细胞培养容器工作性能、产品制造工艺的有效性与可靠性评价的至为关键环节。

2.1 不同品牌产品细胞培养表面的异质性问题

       在组织培容器制造过程中，因注塑成型、表面等离子处理工艺差异，造成不同品牌、型号产品的表面可湿润性、蛋白质结合能力的差异，最终会以细胞附着生长活力的不同呈现。

       不仅如此，因等离子体的活性物质密度、处理工艺控制精度差异，同一批次产品中同一个培养容器培养区内部细胞吸附性能异质性问题，已引起了学界注意。培养区表面性能异质性，即因活性基团构成、分子交联、表面粗糙程度差异等因素，在同一培养皿、培养瓶的培养区内部不同位置，细胞附着力大小不均。培养表面内部异质性的存在，造成用PBS或HBSS等缓冲盐溶液对培养贴壁单层细胞冲洗后，因流体剪切力作用引发部分细胞膜破裂。这种现象在鳞状细胞系 NBT -II、MCF10A细胞及若干上皮细胞系中都被观察到。同一样品部分细胞膜破裂，造成细胞数量损失和胞内组分流失，对培养细胞的分子与生化分析检测误差增加，不同实验室、不同批次实验结果重现性差。不同品牌组织培养瓶中细胞膜的流体剪切破裂量存在明显差异 ^[27] 。

表1  Fluid shear effect of NBT-II cells grown in T-25 of various manufacturers

       培养容器表面异质程度，用差异局部区域面积与整个容器培养区面积比值来表示。而范围的界定通过观察破裂细胞所覆盖表面的面积来计算。比值大，代表表面属性不均匀程度高，对培养细胞检测结果干扰大。

       结果显示，不同制造商25cm²细胞培养瓶内部培养表面异质性（% Fluid shear effec）为4%-20%不等。从表1可以看出，Corning CellBIND培养表面性能均一性仅次于瑞士TPP品牌，优于包括Falcon 353108、Costar 3056两款产品在内的其他标准TC处理表面产品。

2.2 PSM工艺对培养表面“疏水性恢复”的影响

       等离子体活性物质与聚合物表面发生化学反应形成极性管内基团。但分子链上大量极性官能团的存在，却有悖于热力学稳定性规律。常温下，分子内部链段运动，注定了因高能基团出现而获得的材料表面亲水作用和表面能变化通常难以持久维持 ^[22] 。

       聚合物材料表面亲水性能会随着储存时间增加以及温度、湿度等环境条件变化逐渐降低，最终导致材料部分或完全回复至材料原本的疏水特性。PSM相关的聚合物材料改性效果衰减现象，称为“疏水性恢复”(Hydrophobic recovery) ^[28] ，也称为老化效应。

       疏水性恢复的内在机制复杂。主要原因可能与材料表层分子链段重新定向有关。非极性分子链段向膜表面翻转，而膜表面的极性基团向深层内部迁移，造成表面极性基团减少，表面趋向恢复其原始疏水属性 ^[22] 。有报道证实，常温常压环境中储存的改性后聚合物材料，表面极性基团数目随时间推移而减少 ^[29] 。

       疏水性恢复进程与聚合物材料种类、材料分子排列有序性（结晶度）、材料表面生成极性基团类型、材料分子的交联、储存环境温湿度以及储存时间等有关 ^[28] 。

       聚丙烯(PP)和聚苯乙烯(PS)在老化后几乎完全恢复疏水性，而高密度聚乙烯(HDPE)和聚碳酸酯(PC)的疏水性恢复程度较低（见表2）。

表2 Water contact angles of untreated, freshly treated, and aged water plasma-modified plastics

       疏水恢复程度与PSM工艺控制有关。研究显示，氧气微波等离子体对PP材料表面长时间处理后，表面接触角从原生的92°下降到7°，但储存200天后接触角升至低于20°水平。而较低强度等离子体处理的样品的接触角恢复到了45°以上。经氮等离子体处理表面样品初始接触角约10°，储存100天后样品接触角恢复到约42° ^[30] 。经DBD处理的PE和PP表面接触角在处理后的头2至3天内迅速恢复，随后进入一个较长的状态相对稳定时期。到400 - 500天时，数据显示几乎完全恢复到未处理时疏水状态 ^[31] 。

       目前，PSM处理后PS材料疏水性恢复方面的可用数据有限。有报道，含氧表面PS样本的表面化学性质可维持超过1年 ^[7,32] 。如参考PP材料老化时间-接触角测试结果推测，PS经氧气微波等离子体表面处理并低温储存，材料表面亲水性能有效期可维持长达200天或更长。

       疏水性恢复速度主要与分子链本身运动的难易、表面交联程度有直接关系 ^[29] 。材料表面极性基团数目越多，交联程度越高，等离子体改性效果越稳定。用O2等离子体对不同超分子结构的PS膜表面处理研究表明，聚合物材料表面交联度低，分子链热运动运动相对容易，材料表面改性效果衰减程度高。聚合物晶区的规整结构（结晶度高）抑制了分子链运动，疏水性恢复程度降低 ^[33] 。

       疏水性恢复程度与环境温度有关。环境温度升高，材料内部分子链运动加剧，极性基团向材料内部迁移的数目不断增加，造成表面亲水性能退化增速。经氧气射频低压等离子体改性处理PS 材料，在100℃环境下暴露30分钟后，材料表面前接触角（advancing contact angle）恢复至接近未经表面处理对照表面的水平，而在暴露23小时后，改性效果完全丧失。改性后PS材料温度从20℃室温（293K）升至80℃时（353K）时，表面前接触角从40°上升至60°水平，表明材料可湿润性的以大幅退化（见图2）。温度与PTFE材料改性效果时效性之间的关系研究中，同样观察到表面改性效果衰减随环境温度的升高的现象 ^[34] 。

       表面性能衰减程度随环境湿度增加而延缓。亲水改性后的聚合物材料密封与高湿环境，其表面亲水性保持相对稳定。

对于细胞培养容器而言，培养表面疏水性恢复，不仅直接冲击培养实验结果稳定性，还对产品仓储、流通条件控制、产品质保期造成冲击。

(后续：CGT时代的细胞培养表面处理技术创新沉思录-下)