雷惊雨足草木柔——CGT时代的细胞培养表面处理技术创新沉思录-下

（前续：CGT时代的细胞培养表面处理技术创新沉思录-中）

三、等离子体表面改性技术用于细胞培养表面处理的化学逻辑与应用创新方向

3.1 细胞在体外培养环境下贴壁附着的基本原理

       要探究如何通过改进PSM技术工艺以更有效地促进细胞在生物材料表面黏附，还先应捋清细胞在生理、体外培养环境下的贴壁附着的本质原理。

       参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间相互作用的细胞粘附分子（cell adhesion molecule，CAM）,主要包括整合素（integrins）、选择素（selectins）、钙粘蛋白（cadherins）、免疫球蛋白超家族成员（IgSF，包括连接蛋白nectins）及透明质酸粘素（hyaladherin）共五类。其中，整合素主要介导细胞-细胞外基质的相互作用，介导细胞粘附、迁移、分化、增殖以及凋亡等生理过程。目前已发现的整合素有24 种，遍布于哺乳动物各组织器官。每种整合素只能识别并结合特定ECM蛋白配体，如胶原蛋白（Collagen）、纤连蛋白（Fibronectin，FN）、层粘连蛋白（Laminin）、玻连蛋白（Vitronectin, VN）等。此外，不同软硬度的ECM表面，也会诱导整合素传导不同胞内信号影响细胞粘附迁移行为 ^[35] 。

       在添加胎牛血清（FBS）的常规培养条件下，只需纳秒时间，亲水性培养材料表面即形成一层水壳。随后几小时，血清中所含纤维连接蛋白和玻连蛋白等黏附蛋白组分，会吸附在培养表面 ^[36] 。当整合素胞外结构接触、识别和结合配体蛋白后，引发整合素构象变化和整合素分子在细胞膜上的聚簇，通过由外向内(outside-in) 信号激活胞内信号通路。胞内信号通路被激活后，kindlin、talin等结合到整合素胞内域，并通过磷酸化募集vinculin等胞内蛋白，将整合素与细胞骨架蛋白连接形成不同形态大小的黏着斑，以加固细胞在表面粘附。细胞粘附后才开始铺展、迁移、增殖及分化。粘附过程因培养容器材料表面的特性、生物物理环境及生物分子特异性而不同，可持续数小时到数天不等 ^[5] 。因此，培养材料表面的化学性质（疏水性/亲水性）、表面能和表面电荷等理化性质，决定了吸附蛋白质层的组成、密度、构象和取向，进而影响细胞的活动与命运 ^[37] 。

       许多细胞，尤其是原代细胞培养物难以附着于玻璃表面。为在体外细胞培养中模拟细胞体内ECM生理环境，原BD Bioscience旗下Discovery Labware产品部门的Falcon塑料制品公司，从EHS小鼠肿瘤基底膜提取出Matrigel基质，并将I型胶原(Collagen I)、IV型胶原(Collagen IV)、纤连蛋白、明胶（Gelatin）、层粘连蛋白、玻连蛋白等细胞外基质组分纯化后，包被于培养表面用于细胞贴壁培养。与整合素胞外配体多达20余种比，即便是BD Falcon这样的细胞体外培养技术商品行业先驱，可提供的细胞包被基质种类也屈指可数。而为适应细胞对ECM表面和质地的特殊要求，康宁还开发了骨桥蛋白（Osteopontin）、Ultra-Web这类特殊培养表面。

       但数十年来，胞外基质组分包被培养表面产品的开发、应用成本一直居高不下。以Corning Laminin 75cm²细胞培养瓶（354522）为例，2026年市场优惠价分别是CellBIND U型培养瓶（3290）、Falcom Primaria培养瓶（353810）、Falcom TC培养瓶（353024）的13、16、24倍。传统生物机制组分包被培养表面技术成本高、效率低，探索经济简便、高效稳定的细胞培养表面处理方法势在必行。

       也正是Falcon公司在，尝试为玻璃培养表面制备涂层过程中，意外发现了真空环境中使用辉光放电等离子体处理聚PS的细胞培养优势，催生出组织培养PS (tissue culture polystyrene, TCPS) 表面新型制备方法——等离子体表面改性处理技术 ^[7] 。实践表明，多种细胞能在经等离子表面处理表面附着铺展，且形态与玻璃表面培养细胞非常相似。于是从1965年开始，PS培养器皿被用于越来越多地用于细胞的培养 ^[38] 。到20世纪70年代中期，多数研究人员已改用经处理PS材质容器来培养细胞。

        2012年11月，康宁公司并购BD Discovery Labware业务，将Falcon、BioCoat、PureCoat 、Matrigel等产品线全部纳入Corning生命科学品牌管理。自此，Corning旗下形成了Falcon TC、Primaria、PureCoat和CellBIND的四种性能差异化的培养表面体系。而支撑这一体系技术底座的是PSM技术。

3.2 从化学键角度看经PSM处理的PS表面与蛋白的吸附

       众所周知，不管蛋白的亚基数量多少、立体构象多复杂，分子外表面都是蛋白氨基酸残基排列组成的大小不等片段。而所有氨基酸残基暴露于外的是氨基酸残基侧链。侧链组成与结构虽不一致，但不外乎是非极性疏水性侧链、极性亲水性侧链（中性、酸性、碱性）。因此，任一蛋白活性构象的表面，其氨基酸残基的侧链非烷烃类疏水性官能团即极性亲水基团（如-NH-、-C=O）。而溶液中维系蛋白二、三级构象的作用力中，疏水键、氢键的作用最为关键。氨基酸残基片段与溶液中水分子通过-OH、NH2、-C=O作用，在蛋白表面形成水合层。而培养表面也可以通过-OH、-COOH、-C=O、-NH₂、酰胺（-NHCO-CH₃）这些极性基团的水合作用竞争，在培养表面-蛋白之间建立新的氢键网络。如PS表面-COOH作为H⁺供体与氨基酸残基中-C=O形成氢键，而-C=O基团作为H⁺受体与氨基酸残基中的-NH₂形成氢键。这样，通过置换水分子与蛋白间的氢键，可在培养表面实现保留蛋白分子活性的条件下对其捕获。

       有研究指出，材料表面的-OH、-NH₂和-COOH等亲水性基团可在对FN构象变化影响很小的情况下与FN稳定结合吸附。而细胞整合素胞外域识别并结合到配体蛋白分子表面的RGD序列上，才引发细胞粘附增殖活动 ^[37] 。

       早在1983年，就有学者观察到PS表面羟基化会使其对细胞具有良好的粘附性能，认为-OH、氢键形成在细胞与固体表面粘附中的主导作用。还指出，糖蛋白与细胞表面特异性结合效应，在本质上，是因糖苷部分具高密度-OH存在所致 ^[38] 。

       多聚-D-赖氨酸（Poly-D-lysine, PDL）为氨基酸聚合物，包被在培养器皿表面能促进对血清蛋白和细胞外基质蛋白的吸附，增强细胞贴壁。而PDL分子结构的一个最重要特点是，分子表面同时具有-C=O、-OH、-NH-基团，能与水、蛋白分子形密集氢键网络。

       既然细胞是先与附着在培养基质表面的蛋白结合后才稳定粘附。那么，培养表面改性处理目的当然是通过在聚合物材料表面分子侧基和侧链进行-C=O、-OH-NH₂修饰，以便与蛋白表面形成氢键网络。而PSM无疑是实现这一目标的绝佳技术路径。这样可实现不同类型蛋白的有效粘附，而无需考虑蛋白表面电荷属性、活性构型、分子量大小等属性。事实上，已有大量关于PSM方法为多种聚合物材料表面导入-NH₂、-OH和-COOH后提高材料表面细胞黏附生长的报道。

       此外，还可从Corning PSM处理表面PS分子化学特性得到佐证。

       Falcon TC处理的PS分子主链上几乎等比例生成-OH、-COOH两种极性含氧基团。Primaria表面处理后，比Falcon TC表面增加了-NH₂和-CONH₂两种含氮基团，与蛋白相互作用中形成更多氢键，吸附更牢固，可支持多种在传统组织培养表面低吸附性或分化潜力有限的细胞生长，如神经元细胞、肿瘤细胞、心肌细胞（Cardiomyocytes）、人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)、肝细胞（Hepatocytes）、骨骼肌细胞（Skeletal muscle cells）、平滑肌细胞（Smooth muscle cells)等。与Falcon TC表面比，Corning CellBIND表面大部分芳香基团被-COOH和-C=O取代，-OH含量比Primaria表面低。

       总之，PSM处理的目标是材料表面引入-NH₂、-OH等极性基团，便于与表面构象千姿百态的蛋白分子表面氨基酸残基自带-C=O、-NH-基团形成稠密的氢键网络来吸附蛋白。

       此外，从氨基酸分子组成官能团极性看，硫醇基（-SH）＜胺基（-NH₂）＜酰胺基（-NHCO-CH₃）＜醇基（-OH）＜羧基（-COOH），-COOH的极性最大。据报道，相同基质表面分别经-NH₂、-COOH、-OH修饰后，表面水接触角分别降低至49°、24°、17°，显示-COOH具有优良亲水性能。而酸性缓冲液中，-COOH作为H+供体与水分子中氧原子、蛋白表面氨基酸残基的-C=O形成氢键，故-COOH具有较强多肽、蛋白、寡聚核苷结合能力。大量聚合物有关PSM实例中，-COOH均被视作重要改性基团引入。但在pH=7生物学条件下，-COOH作为氢原子供体与氨基酸残基中的-C=O形成氢键的能力被极大削弱。

       原代神经细胞、大鼠原发性胰岛、原发性宫颈上皮细胞、大鼠骨髓间充质细胞、大鼠皮质神经干细胞、小鼠胚胎脑干细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等，PureCoat carboxyl表面都不适用。从报道看，PureCoat carboxyl表面培养应用案例远低于PureCoat氨基表面的应用。

       不同基团修饰表面的细胞培养增殖活力从大到小排名（-OH＞-NH₂＞-COOH＞TCPS）显示，-COOH基团修饰表面的细胞增殖活力低于-OH、--NH₂修饰表面 ^[37] 。有学者指出，材料表面高密度-COOH可能会因抵消部分-OH对蛋白吸附性能而降低材料表面的粘附性能 ^[38] 。

       而其他研究则表明：人类脂肪干细胞（ASCs）在低血清或无血清条件下培养时，PureCoat Amine表面细胞附着不佳，而改用PureCoat carboxyl表面细胞培养后获得成功 ^[39] 。IL-4诱导的巨噬细胞融合及异物巨细胞（foreign body giant cell, FBGC）形成体外实验中，PureCoat carboxy可促进巨噬细胞黏附，却无法促进巨噬细胞融合。而PureCoat Amine表面不支持巨噬细胞黏附 ^[40] 。PureCoat carboxyl表面培养脂肪组织间充质干细胞（AT-MSCs）和PC3、HSC3和HOS143系癌细胞被证实可形 ^[41] 。

       因此，对于-COOH在PS表面吸附蛋白过程中所发挥的作用，目前并无一致意见。

       以材料表面-OH、-NH₂基团的构建为目标，依托多种PSM技术方法，加强工艺研究攻关，是接下来开发高效稳定、适应性强的新型细胞培养表面产品的主要解决方案。

四、CGT应用背景下对新型细胞培养表面产品研发的思考

       19世纪末，意大利经济学家维尔弗雷多·帕累托（Vilfredo Pareto）发现了约20%的人口控制了约80%的社会财富的“80/20法则”。将这一普遍法则应用于经济学领域时可知，20%市场领导者将占据约80%的市场份额，而80%市场者只能挤在剩余20%的狭小空间内博弈。

       细胞培养容器生产研发技术门槛高，市场壁垒厚重。从市场用户角度看，轻易更换现使用品牌产品后一旦实验受挫，不仅造成细胞及配套材料损失，还对项目执行进度造成严重冲击。若新产品的实际性能若无充分确证，寄希望于人们敢吃螃蟹的试错精神和低价策略打开市场，难有成效。Corning等跨国品牌产品，既可提供产品培养实测报告，又有大量公开研究报告可查，容易激发用户接受、尝试新品的意愿。老牌头部厂商凭深厚品牌影响力、存量用户规模和中国生产供应综合竞争力，对市场后来者形成强大竞争排挤压力。倘若抱着“他行，我也行”思想，企图通过引进相同设备和原料材料生产性能接近产品的办法来享分受市场红利，在低端同质化产品泛滥局面下，厂商不仅无法扩大市场份额，还将陷入量价齐跌的窘境，既浪费资源又损害品牌公信力。遵守市场竞争根本法则，顺应细胞培养技术要求，用培养表面创新处理方法建立产品的技术护城河，掌握产品定价权，才是企业和品牌发展的出路。

       等离子体内部涉及流体力学、电磁学、传热学、等离子体化学等多种学科、数十甚至上百种粒子激发与化学反应流程，反应过程极其庞杂。实际研究应用活动中，高精度等离子体诊断设备缺乏和环境影响等不利因素，对等离子体理解难度极大。已知包括等离子体激励电压及功率，改性气体的种类、流量与压力，处理时间等关键工艺参数都会不同程度影响PSM处理效果，但各因素间的关联尚不明确 ^[42] 。为了使聚合物表面更好适合细胞培养，等离子体参数和等离子体种类还需进一步研究。此外，不同细胞系培养所需等离子体活性物种的控制和生成也需要进一步实验工作摸索 ^[5] 。

4.1 CGT时代召唤新型细胞培养表面容器的开发

       TCPS表面通过-NH₂、-OH和-COOH修饰，解决了形形色色的胞外整合素配体与PS表面的非特异性吸附问题。但这种基础型TC表面产品的缺陷显而易见。

       首先，用于培养原代及传代细胞、转染细胞、转化细胞时，对胎牛血清（FBS）等异种动物来源基质成份存在依赖，无法适应新型细胞转化产品开发要求。

       2025年9月颁行的国务院818号令《生物医学新技术临床应用管理条例》、2026年5月1日的发布《细胞组分及衍生物治疗新技术临床研究备案指引（第1版）》规定了“制备细胞组分及衍生物制剂的培养基成份应不含血清及替代物且成份明确”。只有化学成分完全限定、无任何血清/替代物、无动物源复杂成分的化学成分限定（Chemically Defined, CD）培养基，才符合这一新监管框架要求。因此，继续沿用FBS培养基培养模式获得的细胞技术与产品，将只能局限于科研实验室范围应用。这一要求决定着包括类器官、医学组织工程、细胞组分（如重组生物疫苗）、衍生物或细胞亚结构（如外泌体）等以临床应用为导向的先进治疗药品（Advanced therapy medicinal products， ATMPs），从一开始就应以技术路线合规为遵循。

       包括人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）、人类脂肪干细胞(human adipose stem cells, hASCs)、脂肪组织来源间充质干细胞 (adipose-derived stem cells，ADSCs)等工程细胞的临床前研究阶段，在完全无血清（serum-free, SF）/无异种成分(xeno-free, XF)条件下扩增培养时，大量研究报告中采用是PureCoat amine、PureCoat carboxyl、Corning CellBINDBD、Primaria这类具有吸附性能增强型培养表面介质中进行，以缩短细胞粘附时间，提高细胞产量和融合度。因此，开发可适应XF/SF培养模式的新型强效细胞培养表面容器与耗材，是迎接CGT时代市场机遇的必然选择。

4.2 革新工艺提升培养表面性能和稳定性势在必行

       普通TC表面因普遍存在着疏水性恢复问题，造成产品表面性能的有效期短，不利于生产、流通和实验室使用管理。

       公开信息显示，Nunclon Delta 表面处理细胞培养培养瓶的储存质保期（Shelf life）为90天。而BD PureCoat培养表面在15 - 30℃温度保存条件下时，表面性能处可维持至少一年 ^[32] 。而Nunclon Supra表面储存有效期可长达5年。不同类型细胞培养表面产品仓储质保期差异悬殊的原因在于，培养表面的PSM工艺不同：Nunclon Delta 表面用的空气电晕放电等离子体，活性物质密度低，表面处理均匀度差；BD PureCoat、Nunclon Supra表面采用能量密度更高的新型等离子体和特殊工作气体，改性后表面的亲水性能持久。

五、实验室细胞培养容器管理使用需注意的问题

       研究人员中普遍持有一种观点：在组织培养研究中，不应更换组织培养容器制造商，以免影响实验结果和可重复性。这反映了不同厂商的细胞培养表面在细胞粘附、增殖和分化等实际工作性能上参差不齐的事实和对变更产品品牌后潜在实验风险的担忧。

       不同厂商采用的PSM工艺不同，材料表面处理期间的物理效应、化学效应理所当然存在差异，改性后PS材料表面的极性基团种类、分布密度、材料表面形貌（Surface Topography）等理化特征不尽相同，造成对复杂蛋白基质组分吸附的差异，影响到细胞黏附性能，还决定了工作表面性能的均一性和改性疏水效果的持久性。

       同一容器细胞培养区内处理不均匀，造成培养表面细胞附着力差异，在更换细胞培养基时细胞脱落数量不同。另外，在冲洗细胞过程中，局部细胞因流体剪切力作用差异会导致胞膜破裂。这两种情况无疑会对细胞产量、组内组分定量测试数据产生不同程度影响。

       若从供应稳定性、课题经费有效节省角度考虑，需更换细胞培养容器品牌时，首要关注的不应是制造商工厂生产管理是否取得ISO质量认证、FDA准入认证，而是产品培养性能确证信息，如厂商提供的实际应用报告、公开查询到用户研究报告。

       材料表面改性处理时效性研究显示，材料下线一周后，表面疏水恢复进入相对稳定阶段。此后恢复进程随环境温湿度、储存时间不同而渐进式发展。大部分PSM工艺生产细胞培养容器表面性能均非永久性的，只是不同厂商、不同工艺产出的培养表面疏水性恢复进程不同而已。考虑到产品仓储、流通条件差异以及储存时间增加后表面培养性能的下滑，多数情况下，厂商内部细胞培养实测为确保实效，均采用最新生成批次产品而非库存积压品进行。

       全行业内部，对于产品细胞培养性能的监测，目前还只限于生产环节，并未覆盖流通环节。在缺少市场流通产品实际性能定期抽检和失效产品召回制度保障下，细胞培养容器有效期问题值得重视。譬如，某款TC处理表面细胞培养容器保质期为90天，则产品从入库、流通到用户使用的全产品生命周期的时间跨度，必须控制在90天，以确保培养表面最佳湿润性。超出效期使用，实验风险难料，很可能带来大量实验资源浪费。即便是实验室已验证品牌的产品，超出实际工作规划用量，大批量、长期储存细胞培养容器，也不可取。

       当PSM处理表面疏水性恢复问题未被学界提出前，业界对于细胞培养容器这类塑料耗材储存温度控制的必要性，可能还缺乏共识。虽然表面改性塑料耗材的确无需低温冷藏，但长期置于超过室温极限的环境下，材料分子链段、侧链热力学运动处于活跃状态，会加快培养表面老化。因此，PSM处理后细胞培养容器储存环境温度不宜高于30℃，在保存期间避免材料遭受热源烘烤、阳光直射等高温暴露，以延缓培养表面的疏水恢复。

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