雷惊雨足草木柔——CGT时代的细胞培养表面处理技术创新沉思录-上

       闪电又称雷电，是云层内电荷积聚至一定程度后发生高电压、大电流大气剧烈放电现象。世界气象组织(World Meteorological Organization, WMO)确认，2020年4月发生在美国南部的一次闪电长度达768km，成为有记录以来最长闪电。而同年6月的一次横跨乌拉圭和阿根廷边境闪电持续了17s，为迄今为止探测到的持续时间最长的闪电 ^[1] 。在超高能量电场和温度条件下，大气中的O₂、N₂和水分子发生电离，产生多种正负电荷离子、激发态粒子，如N₂+， N₄+，氢离子（H+），负氧离子（O-）等 ^[1] 。氮气在电闪雷鸣间转变成硝态氮和胺态氮，随雨水渗入土壤成为植物生长天然养分。北宋诗人黄庭坚在《清明》中写道：“雷惊天地龙蛇蛰，雨足郊原草木柔”，说明我国古人早就注意到闪电的化学固氮价值。农谚也有“雷雨发庄稼”的说法。

       物理学上，闪电、恒星、星云、极光、地球电离层、高温火焰、电弧放电等都归为等离子体态物质。等离子体（Plasma）是指部分或完全电离的准中性气体，包含自由电子、正负离子、中性离子（激发态或基态）、自由基、光子六种基本粒子，为物质继固态、液态、气态之后的第四种状态 ^[3] 。通过施加能量使气体放电方法建立的人工等离子体技术，在现代工业生产中应用是从20世纪70年代的集成电路生产开始的，后拓展到材料表面清洗、医用材料灭菌、材料表面改性等广泛领域。等离子体处理技术被认为是21世纪最有希望取代传统湿法化学方法的革新技术 ^[4] 。

       材料表面处理所用低温等离子体，分为低压等离子体和大气压等离子体。低压等离子体是工作气体在远低于大气压状态下激励产生。大气压等离子体（atmospheric pressure plasma）是在常压或加压条件下激励产生，主要包括电晕放电（corona discharge）、介电阻挡放电（dielectric barrier discharge, DBD）和大气压等离子体射流（atmospheric pressure plasma jet, APPJ）三种放电形式 ^[5] 。等离子体激励能量分为直流电源、中频电源(频率范围10 - 100kHz)、射频电源(频率范围1 - 100MHz，常用频率为13.5MHz)、微波电源(频率范围0.3 - 10GHz，常用频率为2.45GHz) ^[6] 。

       等离子体表面改性（Plasma Surface Modification, PSM）技术可在不影响材料整体理化特性情况下，改善聚合物材料的表面能、表面化学、表面形貌、清洁度、润湿性（wettability）、附着力（adhesion）和生物相容性（biocompatibility）等表面性能。具有材料消耗低、加工时间短、加工后成品无需进一步净化干燥处理、安全性高的优点，特别适合洁净无菌材料处理。在细胞-材料相互作用中，最初且最关键的事件是蛋白质吸附。吸附蛋白层的组成和结构取决于材料表面的化学和物理性能；并决定了细胞响应和粘附强度。为了促进细胞粘附，通常偏好可润湿的材料表面。

       聚苯乙烯（Polystyrene, PS）材料的透明度高（可见光透过率>95%）、生物相容性好，玻璃化转变温度为95 - 105℃。熔融状态时，PS具有极佳热稳定性和流动性，异于注塑成型或热成型或采用三维（3D）打印技术大规模加工制造，成型后尺寸稳定性好，且生产成本低 ^[7] 。但PS聚合物天然疏水，细胞无法在其表面形成稳定粘附和均匀贴壁生长。利用PSM处理工艺处理，引入包括羟基、氨基和羧基等各种功能基团，或接枝亲水性聚合物到聚合物表面，既保持PS材质的整体性能，又极大改善材料对水溶液、蛋白、组织细胞在材料表面的附着性能，从而有利于细胞附着 ^[5] 。因而，PSM是细胞培养容器生产的一道关键流程。

一、等离子体表面改性技术应用于细胞培养表面处理的主要方法

       资料显示，eppendorf细胞培养皿、SantaCruz细胞培养板瓶、洁特细胞培养板等细胞培养容器，普遍采用USP Class VI安全标准的生物相容性PS制造，经TC处理表面可促进细胞附着。但TC表面处理到底用的是何种类型等离子体却鲜有说明。

       康宁(Corning)生命科学部门是当今细胞培养耗材制品行业的领导者，旗下具有多种类型组织培养处理表面的细胞培养耗材。但看75cm2细胞培养瓶，就分为标准组织培养处理（Tissue Culture-treated, TC）表面培养瓶（Corning 430720U）、CellBIND表面培养瓶（Costar 3290）、Primaria表面细胞培养瓶（Falcon 353824）、PureCoat表面培养瓶（Falcon Primaria 353810）等多款。其TC、Primaria & PureCoat、CellBIND表面分别采用的是大气压电晕放电离子体、射频真空等离子体和微波真空等离子体表面处理技术。这说明，不同PSM工艺改性后培养表面性能是有区别的。

1.1 大气压等离子体表面处理

       介质阻挡放电和电晕放电两种大气压低温等离子体表面处理技术是材料表面处理、薄膜沉积、医疗器具消毒、臭氧合成等工业生成中最常用的两种手段 ^[8] 。

       20世纪60年代, 就已有电晕放电等离子表面处理技术应用的报道。组织培养材料经处理后，PS分子骨架结构上添加羟基(-OH)、羧基(-COOH)等含氧基团，表面变得亲水。Corning公司将大气压电晕放电等离子体处理培养表面，归入“标准组织培养处理”或“传统组织培养处理”表面，即普通TC表面。而许多制造商使用的正是这一技术 ^[9] ，如Nunclon Delta细胞培养表面处理就用了此方法。

       直流高压电源激励气体电晕放电的方法是，在针状电极上施加高电压。当电极上的电荷累积到一定程度，强电场使电极表面附近的气体发生局部击穿而放电和发光。电离只是局限于电极附近区域，活性粒子生成效率低，空间分布不均匀 ^{[5, 10]} 。

       DBD等离子体设备能耗低、放电均匀稳定，等离子体反应区空间较大 ^{[5, 6, 11]} 。不仅适用于聚合物膜、培养皿等开放平整表面处理，还可对形状不规则的细胞培养瓶、细胞转瓶封闭内表面处理。在DBD基础上衍生的常压扩散共面表面阻挡放电 (diffusion coplanar surface barrier discharge, DCSBD)表面处理技术，等离子体密度高、均匀性好、稳定性好，克服了传统DBD和电晕放电等离子体中活性粒子扩散效率低的问题，实现等离子体改性长效稳定性，为改性材料的大规模标准化循环处理提供了有效支撑。

       电晕等离子体处理过程中，由于不同地域、局部气候与气象条件下生产车间空气中N₂、O₂、CO₂、H₂O等反应气体的组成比例不一，等离子体中活性物质组成及含量不稳定，不同工厂、不同批次产品的表面改性处理效果有差异。研究发现，大气压辉光放电气体中加入少量水蒸气、微量O₂或CO₂，会使均匀辉光放电转变成不均匀的微放电丝。此外，稠密气体环境下，自由电子能量和活性物质密度低，表面改性处理存在不均匀现象。因此，在DCSBD技术处理中气体纯度要求是O₂>99.5%， N₂>99.8%，以规避CO₂、水汽和工作环境中有机物残留的干扰，并需实时监测放电参数，以保处理后材料品质稳定性。

       传统TC处理表面属于基础功能版，可在标准血清培养条件支持常见细胞系的贴壁培养。不仅存在表面吸附力分布不均问题，对如视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGCs）等原代细胞(primary cells)、转染细胞(transfected cells)、转化细胞(transformed cells)及苛养细胞(fastidious cells)的吸附力弱，易发生贴壁后细胞脱落（cell sloughing）现象 ^[12-13] 。

       因此，采用封闭等离子反应体系，稳定工作气体输入和等离子反应条件，对确保表面改性品质的控制极为必要 ^[14] 。

1.2 低气压射频等离子体表面处理

       射频真空等离子体(RF vacuum plasma)，又称射频辉光放电等离子体，是在真空反应腔体内输入如氩气、氧气、氮气，将射频功率耦合给电极将气体电离。气体分子所释放自由电子，在稀薄的气体条件、射频源频率为13.56 MH时，随电压交替在电极间往复振荡加速运动，增加了与气体分子碰撞次数，对气体电离能力提高，可以在较大尺度内实现均匀放电，且其活性粒子浓度较高 ^[15] 。低气压具有较低的击穿电压，气体放电易于自我维持，故电极可设置在等离子体放电区外，使离子反应室内部空间开阔，有利于工业大规模处理。而稳定的工作气体组分，封闭的反应空间和优化工艺参数控制，确保等离子体活性物质组成相对稳定。而经处理的培养皿上产生表面持久变化有效期可超过7个月，甚至可能是永久性的 ^[16] 。

       BD公司将此技术应用于TC表面、Primaria表面的改性处理。Primaria表面引入了氨基、羧基和羟基，获得较持久的亲水性表面(permanently hydrophilic surface)效果，可支持包括原代细胞、干细胞、神经元细胞、间充质细胞、肝细胞及内皮细胞在内的多种重要细胞类型。

1.3 微波真空等离子体表面处理

       等离子体中电子与分子(原子)的碰撞是引起分子激发、电离和解离的主要原因 ^[17] 。

       微波电子回旋共振等离子体（Electron Cyclotron Resonance，ECR）利用电子回旋共振原理来维持等离子体放电。在真空室内充入一定的低气压工作气体，微波能量经波导管和微波窗耦合到等离子发生器中，在反应室四周固定电磁线圈或永磁体提供静态外磁场。875Gs磁场强度下电子回旋共振频率与2.45GHz的微波频率一致，从而发生回旋共振，使电子在碰撞前吸收的微波能量最大化，提高电子轰击后气体分子的解离度，获得高密度等离子体。而等离子体样品反应区处于高密度活性物质聚集的等离子体下游，活性粒子与材料表面充分相互作用，处理均一性好。相较于其他类型等离子体处理法，对材料表面的C=O、-C00H和-OH功能基团含量提升具有显著优势 ^[18] 。等离子发生器无需安装电极，避免电极成份污染。而等离子体反应室空间大小可根据样品调整，既可容纳滚瓶、培养瓶、多孔板等异形样品容器，又避免因等离子体活性粒子与样品室内表面相互作用产生污染物。特别适合对温度敏感材料表面改性和等离子沉积等高纯物质制备处理 ^[19] 。

       Corning在2008年推出的CellBIND培养表面的改性处理，采用Astex 2.45GHz下游微波等离子体技术（downstream-microwave-plasma, DMP）。在等离子体发生前，培养容器、反应室内的空气被抽出，以保证等离子体活性组分稳定性。在优化工艺条件下，高反应活性等离子体处理后的CellBIND表面，芳香基团（aromatic group）减少，C-O-C、C=O、羧基、羟基类含氧官能团增加。分析显示，CellBIND表面的氧含量比标准TC处理表面高68%，比胺类基团表面高出105%。表面水接触角（water contact angles, WCA)测定结果显示，CellBIND表面为12°- 16.3°，TC表面为56°- 64°，胺基表面为74.9°。显示了CellBIND表面比标准TC处理、胺基表面具有更高效的润湿性。同时，ellBIND表面处理材料具有优异稳定性，表面处理层不会被去离子水冲洗掉，保质期长 ^[9] 。

       相较于RF或Corona处理工艺，CellBIND表面增强了细胞贴壁稳定性，降低细胞脱落率，提高难培养细胞增殖效率和细胞产量。对无血清条件下培养表达重组蛋白的CHO细胞培养结果显示，CellBIND培养表面在培养14天后未出现细胞脱落，表明CellBIND表面可促进细胞贴附。

1.4 等离子体增强化学气相沉积处理

       等离子体增强化学气相沉积（Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition，PECVD）是一种将等离子体技术与化学气相沉积（CVD）方法相结合的薄膜制备技术，为生物应用中形成功能性聚合物薄膜最常用的方法之一。其基本原理是：在温和真空条件下，通过施加射频或直流电场、微波能量等激发有机前体化合物气体/蒸气产生等离子体，等离子体中活性粒子与材料基底表面发生聚合化学反应，以化学键形式沉积在基底表面形成晶核，晶核生长再形成连续功能性聚合物薄膜。聚丙烯胺(allylamine, AAm)、丙烯酸（acrylic acid, AA）和异丙醇常作为PECVD工艺中的前体，这可以促进人类成纤维细胞的可控粘附。传统上，等离子体沉积的聚合物薄膜被广泛应用于控制可植入设备表面细胞的粘附，如血管假体、眼内镜片及可植入电极和导管 ^[20] 。

       BD依托射频辉光放电等离子体处理系统，采用的独特功能单体，通过PECVD方法在PS材料表面沉积形成纳米厚度的薄膜涂层制作羧基(PureCoat carboxyl)或胺基基团(PureCoat amine)表面 ^[21] 。

       PureCoat细胞培养表面，化学定义明确、无动物源成分，可在标准培养条件、无血清或低血清条件下显著增强原代细胞(primary cells)、转染细胞(transfected cells)、转化细胞(transformed cells)及苛养细胞(fastidious cells)的贴壁能力。资料显示，大鼠脑组织的视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGCs）接种于经TC处理的24孔、CellBIND多孔板或Corning PureCoat氨基涂层板中，并培养于含10%血清、谷氨酰胺和氯化钾的培养基内。培养20至22小时后，RGC 细胞能在PureCoat胺涂层表面良好贴附并分化，并可观察到神经突生长现象。而在TC处理及CellBIND多孔板上培养的 RGC 细胞均未贴壁，并在固定过程中被洗脱。说明RGC细胞在PureCoat amine基底上的贴壁率及分化能力均显著增强。

1.5 表面等离子体接枝聚合处理

       等离子体引发的接枝聚合(Plasma Induced Graft-Polymerization)包含等离子体接枝、等离子体聚合两种工艺。

       等离子体聚合通常是指单体,如C₂H₂、C₂H₄、苯乙烯、丙烯酸（Acrylic acid）、烯丙胺、丙烯酰胺等在等离子体环境下聚合形成涂层的方法。采用直流激发丙烯酸低压等离子体原位聚合到LDPE 表面对LDPE 膜表面进行亲水性改造。

       等离子体接枝是通过等离子体处理将大分子化合物共价接枝到聚合物表面，利用大分子链自身的化学特性来改善聚合物材料表面能、亲水性、黏附性能等表面性能 ^[22] 。接枝层与材料表面分子以共价键结合，故改性效果稳定持久 ^[23] 。

       用射频低压氧等离子体方法处理PS材料表面，成过氧基或自由基，再将经预处理表面吸附有N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）单体的PS以氩气等离子体处理，NVP单体发生接枝聚合，可使样品表面氧含量增加的同时新增-CON-官能团，改善材料表面润湿性，提高细胞在材料表面黏附和生长 ^[24] 。等离子体接枝表面在经无水乙醇、去离子水多轮超声清洗后，表面亲水性能依然保持完好。

       聚乙烯（PE）、PS先经氩气等离子体进行表面子体活化，再在表面聚乙二醇（PEG）等离子体接枝处理后，发现接枝导致聚合物表面形貌、粗糙度和润湿性显著变化。大鼠血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell, VSMC）培养结果，细胞在改性聚合物上的附着和增殖都有所增加，尤其是在PS材料表面，且胞增殖随PEG分子量增加而增加明显 ^[25] 。

（后续：CGT时代的细胞培养表面处理技术创新沉思录-中）