操作规程
脑类器官——人类大脑穿越了20万年的邂逅
人脑包含大量神经细胞和神经胶质细胞。神经细胞也称神经元(neuron)，数量约1000亿个。每个神经元与其他神经元能形成约1000多个可相互联系的突触(synapse)。这些突触在大脑形成了各式各样、大大小小的信号传导环路，而每个神经元可能是多个环路的一部分。脑功能活动是通过无数神经元及其突触所建立的纷繁复杂的神经网络实现的。神经胶质细胞(neuroglial cell)有多种类型，包括少突胶质细胞(oligodendrocytes)、星形胶质细胞(astrocytes)、小胶质细胞(microglia)、室管膜细胞(ependymal cells)、雪旺细胞(Schwann cells)和放射状细胞(radial cells)，主要是对神经元起支持、保护、营养和绝缘等作用，并参与神经递质和活性物质的代谢和神经系统的免疫过程 [1] 。脑通过对不同神经元环路对信息进行整合，并结合与之有关的触觉、听觉体验以及既往经历与记忆等，形成一个完整的知觉体验，确保人类行为和精神活动的灵活性、稳健性和功能多样化。
大约在20万年前，现代人类大脑进化成功时，脑神经元排布和利用率比远古古人要高得多。最近1-1.5万年间，人类大脑白质和灰质的比例还在进一步进化。现代人类大脑容量、结构和高级认知功能，与其他灵长类动物、啮齿动物间都已存在巨大差异。人脑高级功能的特殊性，加之文明社会的法规、医学伦理学和条件限制，要想透彻理解神经精神疾病的生物学基础，还面临重大技术挑站。
一、经典人脑神经精神疾病研究手段的缺陷
迄今为止，科学界使用了一系列技术来研究脑部疾病，而每种方法都存在难以克服的缺点。
1.1 神经病理学分析法
人类遗体神经病理学分析方法的运用，帮助医学界重新定义了许多脑部疾病的分类。如帕金森病患者脑组织中黑质多巴胺能神经元的丢失，在阿尔茨海默病患者脑组织中淀粉样斑块和神经原纤维缠结沉积，在精神分裂症患者的海马体积缩小等。但神经病理学观察结果相当于“反应终点读数”，对疾病机制的动态过程了解有限。
1.2 动物模型法
处于不同进化距离的哺乳动物间，蛋白质编码基因相近。譬如，人类和黑猩猩进化历程不仅接近，体内同源蛋白序列平均仅相差两个氨基酸，还可有效模拟许多人类的认知、行为和社会特征。但动物资源来源有限约，也有悖于动物实验3R原则［2］ 。
小鼠和人类的同源蛋白质编码序列虽然也有85%的相似性，对于用实验动物模拟人因基因突变所致疾病固然有重要价值。但因啮齿动物则与人类之间基因组因进化积累的巨大差异，对人类神经精神疾病和人脑高级功能的模拟能力，则值得商榷。已有越来越多的研究证据，从多个维度证明了这一点。
人类基因组中，只有不到2%的序列为蛋白质编码基因（外显子)，其余的98.5 %都属于非编码序列（内含子)。据报道，30多个亿DNA碱基总计42611个基因中，仅20352个是潜在外显子，其余22259个是均为内含子 [3] 。而小鼠基因组总长约27亿个碱基，蛋白编码基因数量为22113 个[4] 。只有40%的人类基因序列上与小鼠的参考基因一致。因此，人类基因组大，染色体长度长，蛋白编码序列位点分散，非编码序列平均长度更长，数量更多。而启动子、终止子、增强子等基因转录调控元件就分布于广袤的基因组非编码区。
人类细胞中基因组DNA序列，如完全展开将是长达2米核苷酸链。人类经数百万年进化形成了复杂染色质三维空间结构，将基因组DNA链折叠压缩约30万倍成功地装入直径约5μm的细胞核。细胞在不同发育阶段、功能状态下能精准实现相关基因的表达，执行细胞生物学任务，关键就在于基因组精巧折叠的三维结构以及动态调整功能。而拓扑关联结构域（Topologically Associating Domains，TADs)则是染色质结构和转录调控的基本功能单位 [5] 。
TADs为基因组中功能相对独立的环状染色质区段，其内部DNA存在密切的相互作用。TADs的中部一头为蛋白编码基因，另一头为非编码调控序列，而TADs的两端是一对高度保守、方向相反的CCCTC序列。与CCCTC序列特异性结合、参与染色质环(chromatin loop)架构形成的是多功能转录因子——CCCTC结合因子（CCCTC binding factor, CTCF)或称为CTCF蛋白。黏连蛋白或粘合素（cohesin)是一种环绕DNA分子的环状大分子复合物，可与CTCF形成复合体发挥协同调控作用。根据染色质结构域形成理论——环挤压模型（loop extrusion model)，黏连蛋白通过消耗ATP能够在DNA上滑动，直至遇到CTCF与DNA的结合所形成的“路障”而停止。黏连蛋白在滑动时会将穿过的DNA外推挤成环状结构。环挤压原理将DNA线条环化后，DNA链上原本直线距离较远的DNA片段，如增强子与调控基因的距离得以相互靠近而发生相互作用。增强子(enhancer)、沉默子(silencer)等顺式作用元件通过与启动子(promoter)、转录因子（transcription factor)结合，在TADs内部完成基因表达的调控。TADs两端的CTCF结合位点的分布距离决定了TADs中染色质环的大小，即CTCF与黏连蛋白复合体位置确定了TADs的结构边界（domain boundary)。而在TADs边界富集的cohesin和CTCF，则可阻隔不同TADs间增强子-启动子跨越TADs接触，防止异常基因表达发生。以cohesin和CTCF为核心的TADs边界具有绝缘作用，故称为绝缘子(insulator)。
TDAs由边界元件和基因转录起始位点（transcription start site, TSS)等TDAs两侧的周围基因组环境（genomic context)共同决定 [6] 。是CTCF结合位点侧翼的序列而非核心基序决定了绝缘子阻隔增强子功能。研究表明，边界区域CTCF位点反转会引起TADs边界漂移，形成新的TAD而影响基因表达［5］。多个顺式串联的 CTCF 结合位点元件串联，可提供比单个CTCF结合序列具有更强大的强绝缘效应 [7] 。因此，TADs边界基因片段的缺失、插入、位点的突变等造成的基因环境差异，会改变TADs结构，进而影响基因转录。
不同物种基因组大小，决定了染色体的总长度和基因组三维结构，造成了TADs调控单元的物种间差异。对比人类、猕猴和小鼠的大脑，发现了超过1000个人类特异性染色质环路。从人类、猕猴、狨猴和小鼠初级运动皮层中分离出的TADs边界元件中，有3-6%是人类特有或偏向于人类。这些人类特异性TADs边界序列可为转录因子创造新的结合位点，形成新的调控机制。物种基因组TADs结构域塑造的基因表达调控差异，决定了个体和物种间的显著差异。
譬如，板下神经元（subplate neurons, SPNs)是大脑皮层发育中最早出现的临时神经元之一，对丘脑-皮质听觉信息神经回路的形成和可塑性起关键作用。人类胚胎通常是在孕期12周时发育出SPNs，而小鼠则是在胚胎发育第二周才出现。SPNs发育进程中物种基因表达时间轴的不同步，正是TADs内部差异化基因调控的结果 [8] 。
另一个例子是人类加速进化区(human accelerated regions，HARs)。HARs是指人类基因组中一些人类特异性的、高度保守DNA短片段。相比其他物种基因序列在漫长进化过程中的保持高度保守性，人类这些区域在相对较短的进化过程中却积累了大量变异。HARs与神经发育相关基因的增强子和疾病相关基因座分布重叠 [9] 。因此，HARs被认为是人类大脑发育、认知力、语言和其他复杂行为等人类独有生物学特征。
HARs和人类特异性TADs研究，都强调了非编码区对人类基因表达调控的重要影响，是造成人类与其他物种相比在认知能力和大脑结构显著差异的关键因素之一。
其实，不单在DNA分子层面，大脑细胞表型也存在胞跨物种差异。对人类和小鼠星形胶质细胞的比较，确定了600多个人星形胶质细胞中的差异表达基因。端脑（telencephalon)为人类大脑中最大、最发达的部分。小鼠和人类的成年大脑中，中间神经元的组成类型与相对比例、分布和基因表达模式存在广泛差异。在人脑中发现了两种人特异的中间祖细胞 (intermediate progenitor, IPCs)类型，一群来源于尾神经节隆起(caudal ganglionic eminences, CGE)的SCGN+CALB2+细胞，另一群来源于内侧神经节隆起(Medial ganglionic eminences, MGE)的CRABP1+NKX2-1+细胞。这提示了人与小鼠在中间神经元细胞类型多样性上存在差异 [10] 。
人类常见的重度抑郁症(major depression disorder, MDD)、双相情感障碍(bipolar disorder, BP)、精神分裂症(schizophrenia, SZ)等精神疾病，以严重认知、情绪和行为障碍为特征，被认为是多个基因变异或表达异常的脑发育疾病。如，单一DISC1突变同时与自闭症谱系障碍(ASD)、SZ、BP和MDD有关。人类神经系统结构、功能和行为的复杂性，对用其他哺乳动物来表征人类精神障碍构成了重大限制 [11] 。当然，通过基因编辑建立的转基因动物模型在神经精神病理学研究中依然是行之有效而宝贵的手段。
1.3 人类干细胞来源的细胞2D培养模型
由于无法从人体直接获取重度抑郁症(MDD)等神经精神疾病患者的脑活检或培养原代神经组织，采集患者来源的体细胞，在实验室用经典病毒载体导入法或小分子化合物诱导重编程方法转化为人诱导的多能干细胞(Human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)，随后将iPSCs进一步分化，可获得如5-HT能神经元、多巴胺能神经元、GABA能中间神经元(GABAergic interneurons, GINs)、脊髓运动神经元及和神经胶质细胞等多种具有个体特异性遗传背景的脑细胞谱系。目前，用hiPSCs来源的单层2D 体外神经元培养物，可直接观测神经元和神经胶质细胞的神经突生长、突触发生成、基因转录、蛋白表达、神经递质释放和电生理特征，了解正常与异常神经组织分化的机制和识别响应给药反应 [12] 。通过体外神经组织分化建模和测定的方案，克服了动物模型模拟神经精神疾病方面的局限性，为研究BP、MDD等疾病的神经生物学机制研究提供了极大便利 ［1］ 。
研究表明，与来自健康受试者成纤维细胞iPSCs来源的神经元比，MDD患者iPSCs分化的神经元除了生物能量和线粒体功能受损外，电生理特性也发生变化，表现为较低的膜电容、静息膜电位和钠电流，此外细胞更小，并有较高的自发活动活性 [13] 。
对抗抑郁药选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（Selective Serotonin Reuptake Inhibitors，SSRIs)有效患者和健康对照者iPSCs分化的神经元相比，SSRIs无反应MDD患者iPSCs来源的前脑神经元兴奋性和对5-HT的反应性更高、HTR2A和HTR7受体表达增加。阻断这2种受体可抑制神经元过度兴奋 [14] 。SSRIs无反应MDD患者iPSCs来源神经元显示神经突触更长 [15] 、皮层神经元突触连接减少及树突棘数量和类型的损害，并出现NPPB、LRRC15、MICB、CHMP4C和ITGA2基因表达异常 [16] 。 SSRIs无反应MDD患者iPSCs来源GINs也出现可塑性受损，具有更多神经突分支，证实这些神经元中 HTR2 的下调。而HTR2激动剂曲唑酮治疗可恢复GABA能神经元的活性和神经突分支异常 [17] 。
对MDD患者iPSCs来源星形胶质细胞(Astrocytes)每48小时用5μM皮质醇处理一次，连续给药7次后， MDD患者iPSCs组星形胶质细胞显示出与GPCR结合配体、突触信号传导、离子稳态和对皮质醇慢性反应有关的差异表达基因(DEGs)、呼吸速率、耗氧量、钙含量、细胞大小和 ROS的变化 [18] 。
MDD患者iPSC来源的神经元祖细胞(neural progenitor cells, NPCs) 也显示出氧消耗减少、质子渗漏（proton leak)、细胞表面积减少、呼吸潜力下降等反映细胞线粒体功能和生物能量谱方面的异常出反应 [13] 。
总之，MDD患者iPSCs来源的各种细胞存在不同程度的形态、电生理特性以及差异基因和蛋白质表达方面的异常。
传统细胞2D培养物优势在于实验培养、观察和测试方法简便，可以大规模扩增，适于高通量筛选测试。其主要缺点在于无法为不同脑区复制神经元和神经胶质细胞的复杂有机结构，无法复制在体细胞的迁移、分化和细胞间相互作用模式。此外细胞工作寿命较短，无法有效模拟细胞发育成熟过程 [19] 。
二、人脑类器官技术开辟了神经精神疾病研究突破的新途径
人脑类器官是由人类多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs)衍生的祖细胞、神经元和胶质细胞等多种类型细胞自我扩增、自我组装生成的三维组织结构 [20] 。它是传统二维(2D)细胞培养与新型细胞外基质相结合的迭代技术，它复制了单层培养物中发生的大脑结构和组织特征，模拟了生理性细胞间相互作用，如神经元间连接的建立、神经递质的产生和突触活动等功能。与单层培养相比，类器官的优势是能够在体外长时间维持，有利于细胞的发育。譬如，皮质类器官中的星形胶质细胞，在培养 9-10 个月后开始类似于出生后原代人类星形胶质细胞。因此，类器官培养比2D细胞培养，更适合用于理解控制神经元和神经胶质细胞成熟的机制和开发与年龄相关的神经退行性变的人类细胞模型 [21] 。在细胞水平、体系结构层面和释放各种信号分子功能上，脑类器官对人类皮层在妊娠早期到中期的发育特征实现高度概括，成为具有复杂遗传起源且难以在动物中建模的人类疾病研究的宝贵工具 [22] 。
遵循体内发育轨迹，通过不同化学线索的时间定义模式，引导脑细胞定向分化，可生成具有不同脑区结构和神经化学特性的区域特化类器官或大脑区域特异性类器官(brain region-specific organoids)。从2013年成功构建脑类器官报道 [23]以来，已开发了大脑皮层（cortical organoid, 对TGFβ和WNT信号通路干预)、海马体和脉络丛(Hippocampus and choroid plexus，对BMP和 WNT信号转导的干预)、神经节隆起(Ganglionic eminence, SHH和WNT活性调控)、腹侧前脑（激活SHH和WNT信号通路)、中脑(用 SHH或/和FGF8处理)及脊髓等与多种类型人脑类器官。
精神疾病往往涉及多个大脑区域的细胞结构、功能和相互作用。将不同区域特化类器官共培养，类器官的自我组装功能，可构建出包含2个、3个或更多大脑区域组成的复杂系统——类器官组装体(Assembloids)，以模拟相关脑部疾病的跨区域相互作用，如细胞迁移、轴突投射和突触形成，以及功能相互作用。皮质-纹状体间的单向轴突投射，丘脑-皮质间轴突投射，可控制肌肉收缩的皮质-脊髓-肌肉回路连接。具有更复杂细胞群组成、区域相互作用类器官组合开发和应用，将推动相关精神疾病的研究 [24] 。
将脑类器官与hiPSC衍生的小胶质细胞或巨噬细胞前体等非神经元细胞共培养，生成共培养类器官（Co-cultured organoids)可实现类器官细胞组成和功能的多样性。如神经祖细胞和巨噬细胞祖细胞共培养可产生具有可控小胶质细胞比例的皮质类器官，可改善的突触修剪、组织成熟度。将人干细胞与hETV2的细胞或人脐静脉内皮细胞共培养，可以产生具有血管样结构的皮质类器官，提高类器官的持续培养时间。
而类器官养技术与基因工程、基因组编辑、高通量单细胞转录组学和表观遗传学等新技术手段结合，充实了研究人脑发育和神经精神疾病的工具箱 [25] 。
当然，脑类器官应用仍处于起步阶段，在构建技术上还有诸多短板。有些技术缺陷，如工作寿命和靶器官仿真度，是当前整个类器官技术研究领域普遍存（可参考：类器官实验技术作为新质生产力的现状、困境和认知误区）的阶段性难题。譬如，人脑类器官只能模仿胎儿或出生后早期大脑的发育阶段，而非成熟大脑，这与多数精神疾病是出生后或成人阶段发生的应用背景不匹配。当然，已有报道通过技术改进，如采用脑切片 [26]、有气液界面的培养环境 [27]、靶向多个信号转导通路的化合物组合干预 [28] 或异种移植等方法，使类器官得以长期培养并维持稳健，有利于加速其发育成熟进程。其次，是脑类器还无法完全重现人类大脑真实组织结构。如人皮质类器官中还不具备成熟大脑皮质内部完全定义的六层结构。第三，尽管出现了各种脑区域特异性类器官和组装体方法，但组合体无法实现在不同区域之间产生平滑而连续内在多区域发育过程，无法概括大脑区域发育过程中的神经回路形成动力学特征。还不适应对内源性多区域大脑的发育和相互作用以及疾病过程研究的要求。此外，选择一个既可以调节人体全身功能活动、自身又具有特殊复杂思维意识及行为决策功能特殊高级靶标，脑类器官的构建还有其特殊技术困难与不足。譬如，神经元在漫长的发育过程中，存在外部信号依赖的调控，此间各种处理造成的细胞应激上调，可能会阻碍细胞类型的定义。类器官生成过程常规使用的高浓度化学分子信号，也可能会掩盖在某些病理条件下发育过程病理表型。因此，人们需要谨慎解释来自类器官模型的实验数据 [25] ，以免稍有不慎而对科学界和公众造成误导。
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