类器官实验技术作为新质生产力的现状、困境和认知误区

       类器官，是指用来自胚胎、细胞重编程诱导、人体或动物组织的干细胞/祖细胞，在体外经培养扩增、诱导分化后，自我组装生成具有特定器官的细胞谱系构成、可模拟在体动物脏器的一些基本功能活动特征的三维结构细胞簇，属于体外细胞模型的范畴[1]。

       2009年，荷兰科学家Hans Clevers团队首次利用表达富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5, Lgr5)的小鼠肠道干细胞在体外培养出具有隐窝-绒毛结构的肠组织，标志着类器官技术正式诞生[2]。此后，包括肠道[3]、结肠[4]、视网膜[5]、甲状腺[6]、胰腺[7]、大脑[8]、食道[9]、前列腺[10]、胃[11]、肝脏[12-13]、肾脏[14]、输卵管[15]、唾液腺[16]、子宫内膜[17-18]、乳腺[19]、肺[20]、血管[21]、皮肤[22]、心脏[23]等，数十种人类器官相继开发问世，引起了科学、产业界的极大关注。

       类器官实验技术方法的成功探索，被视作推进生物学研究的重大突破，先被Nature Methods评为2017年度技术，登上2019年Science杂质的封面，还被《新英格兰医学杂志》（The New England Journal of Medicine，NEJM）评为优良的人类临床前疾病模型。 

一、类器官相关技术研究应用基本现状

       与常规2D 细胞培养物比，类器官具有真实器官类似的细胞组成、结构和部分功能活动，可还原体内细胞分化与细胞迁移，以及细胞之间、细胞与细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)复杂的相互作用。类器官的形成过程本身即是对组织器官真实发育过程的模拟。因此，类器官为科学家理解组织器官发生、早期发育等关键问题打开了一扇新的窗户。研究人员用大脑类器官构建了人类大脑发育的多组学图谱，揭示了人脑早期发育过程中的基因调控网络[24]；而依托人类干细胞构建的囊胚、原肠胚等早期胚胎类器官，人们可直观地观察到胚胎的整体构造和早期发育过程，揭开了人类胚胎发育阶段的 “盲盒”[25]。

       在疾病致病机理研究方面，通过干细胞受控定向分化、基因编辑方法，类器官技术有望解决疾病模型缺乏、动物建模难题，为人类特有的、罕见病、遗传性疾病、癌症和传染病等疾病的发生发展机制等研究、探索新治疗靶点和新疗法提供了全新机遇。譬如，SARS-CoV-2重度感染者除呼吸症状，代谢、心脏、神经、肠胃系统并发症的出现也困扰着医学界。为验证SARS-CoV-2对除肺部以外其他器官的靶向性和并发症的发生机制，研究人员就用各种类器官模型开展了模拟感染的实验研究[26]。

       采用患者自身组织细胞分离的干细胞培养、诱导和定向分化可生成的与患者器官表型相同的类器官。类器官技术与与CRISPR-Case9基因组编辑技术相结合，可进行患者有缺陷的基因而提供“健康基因”表型的类器官，作为再生医学(regenerative medicine)生物材料来源，进行自体移植，可有效规避免疫排斥反应和规避致瘤性（Oncogenicity）风险。目前已从小鼠和人类多能干细胞中重建了三维肾小管和肾小球，有望将为尿毒症晚期患者实施肾移植方案所需的肾脏来源障碍开辟了一条全新途径。而在个性化医疗（Personalized medicine）模式背景下，患者来源的类器官（Patient Derived Organoid，PDO）作为先进疗法药品（Advanced Therapy Medicinal Products, ATMP），正越来越多地被用作为病人量身设计最佳治疗方案的工具[1]。

       生成类器官所用的各种干细胞材料可长期稳定储存、培养、传代和扩增，且实验条件、操作流程易于标准化。细胞材料遗传背景可长时间保持稳定，确保类器官的生产的稳定性、可持续性和高通量的优势。同时，研究人员能实时直观简便观察类器官及细胞内部动态、微妙变化。作为药物发现和筛选平台，类器官避免了动物实验与人体的种属差异，能够更准确、更快捷提供药物在人体内的有效性和毒性实验数据，便于在第Ⅰ期人类临床药物试验前，将药物安全性和有效性测试融合进行。临床志愿者因此而免于承担无效药物的副作用和安全风险，这将缩短临床前试验与临床试验的周期，大幅降低药物开发投入[27]。因此，类器官技术作为一种全新的体外模型，将直接推动药物研发模式的新一轮变革。

       当前，业界已建立起多种用于药物筛选的类器官技术体系，并在药物研发领域应用进入产业化阶段。譬如，科学家通过构建多囊肾病类器官平台，实现了囊肿形成抑制化合物的高通量筛选。癌症药物开发领域，已构建起大肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等多种癌症的类器官库，既保持肿瘤的异质性，又较好展示肿瘤对药物的敏感性。辉瑞、赛诺菲、阿斯利康等大型药物企业在新药研发中引入类器官技术平台，实现药物研发流程优化[26]。

       据报道，2015 年以来，全球类器官技术相关研究文献和专利数量呈爆发式增长。2010-2021年间，全球672 项类器官相关专利主要由中国、美国和韩国申报，其中79.46%属类器官的构建、制备和维持相关技术[26]。

       从肝类器官研究论文发表数量看，从2020年开始，论文的数量进入快速增长期，且呈逐年递增趋势。2024年论文总数为711篇，2025年1-4月份发文总数达到214篇，几乎相当于2019年全年发文量（见图3）。

二、类器官模型的主要类型

       目前已报道的“类器官”或与类器官相关体外三维细胞模型，大致可归为以下7种类型[1]。

1）肠道类器官（intestinal organoid）

       肠道类器官可患者肠组织活检（intestinal biopsies）分离的Lgr5+肠道干细胞(intestinal stem cells, ISCs)在体外培养扩增形成。它具有肠隐窝（intestinal crypt）形状的空心对称球状结构，内部具有完整的肠道上皮结构，含有包括肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞(Paneth cell)和Lgr5+干细胞在内成人肠道中发现的所有细胞类型[2]。

       目前的肠道类器类器官尽管可模拟体内稳态环境下干细胞及其分化细胞的相互作用，但无法呈现器官组织损伤再生状态下的变化。这是由于在真实体内环境下组织损伤诱导的再生过程中，是由损伤态肠道干细胞来主导组织损伤修复过程。而如何稳定地捕获并维持损伤态干细胞亚群，是类器官研究及应用面临的重要挑战。研究人员在常规小肠类器官模型基础上，通过建立包含有VPA、EPZ6438、LDN193189 和 R-Spondin 1等8个小分子化合物组成的培养条件，诱导小肠类器官细胞损伤再生相关基因表达，并生成更复杂的三维结构，与体内真实条件下肠道损伤再修复过程出现的“增生态”隐窝非常相似——增生态小肠类器官(hyperplastic intestinal organoids, Hyper-organoids)。Hyper类器官的扩增能力得到极大增强：连续培养5代之后，小肠干细胞数量提升近10000倍，并在长期传代扩增中保持基因组的稳定性。这一新型类器官模型，解决了类器官技术在体外无法模拟损伤再生条件下器官和组织变化的难题，同时具备在体外高效扩增和长期维持的能力，为溃疡性肠炎结肠上皮修复、建立疾病损伤模型和药物筛选提供了新的途径[28]。

2）神经类器官(Neural organoid)

       患者来源的成纤维细胞[29]、淋巴母细胞样细胞系（Lymphoblastoid cell lines, LCL) ［30］或人外周血外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)［31］被重新编程后成为诱导多能干细胞(induce pluripotent stem cells, iPSCs)——诱导神经元祖细胞（NPC）分化构建的3D神经类器官，可模拟人体脑神经回路的结构和功能、了解大脑发育或神经发育过程，对于深入理解神经精神疾病的发病机制以及开展药物筛选和转移实验提供新的手段。因缺少有效人源性细胞模型，重性抑郁症(MDD)患者自杀行为发生机制研究一致无法进行。而利用携带患者来源的iPSCs分化为GABA能中间神经元 (GABAergic interneurons, GINs) 和包含GIN的腹侧前脑类器官进行研究揭示了人类神经元和腹侧前脑类器官中MDD相关的重要细胞表型，为确定治疗方法提供了新的思路。

3）肿瘤类器官(Tumor organoids)

       从患者肿瘤组织中分离的癌细胞体外扩增生成的肿瘤类器官称为患者来源肿瘤类器官（Patient-derived tumor organoids, PDTOs），具有与原始亲代肿瘤近似一致的三维结构、基因谱系和病理学特征，能较准确地模拟肿瘤在体内的微观形态[32]，克服患者来源癌细胞(Patient-derived cancer cells, PDCs) 、患者来源肿瘤异种移植(patient-derived xenografts, PDXs)模型细胞多样性不足的缺陷，可用于癌症建模、个体化治疗、肿瘤药物筛选、肿瘤免疫治疗和转化医学应用[33]。

       自2011年首次成功构建结直肠癌类器官以来，研究人员已经构建出前列腺、肠道、胃、肝脏、胰腺、乳腺、膀胱和大脑等多种高发病率、高死亡率人类肿瘤类器官并实现商业化应用[32]。胆囊癌(Gallbladder carcinoma, GBC) [34]等相对少见的恶性肿瘤模型也以陆续建立。有利于推动恶性肿瘤的分子致病机制研究、发现肿瘤新治疗靶点和个性化抗肿瘤化合物的开发。

4）类器官胚胎模型(Embryonic model)

       通过干细胞衍生的胚状体和类器官并整合生物工程技术，科学家们能够部分重现胚胎发育过程中细胞谱系多样化和组织形态发生的发育事件，包括长距离组织模式和形态动力学、组织间的相互作用，以及有机体级别的组织和功能[35]。

5）类器官芯片(Organoid-on-chip)

       类器官芯片发源于器官芯片（Organ-on-chip），同属于微生理系统（Microphysiological System, MPS）范畴。微生理系统是一种体外构建的细胞培养平台，用于对人类、动物的特定组织或器官功能特征进行体外建模，可精细调控细胞生长的微环境和微流体流动条件，模拟组织器官的病理生理变化[36]。

       器官芯片则是专指在芯片上构建的微生理系统,是以工程化微流控装置（microfluidic devices）为核心, 结合细胞生物学、生物材料和工程学等技术方法构建的包含有多种活体细胞及功能组织界面、生物流体和机械力刺激等因素，可反映人体组织器官的主要结构和功能特征的组织器官体外模型。最早开发的器官芯片为2010年创建的肺芯片，是一种载玻片大小的双层夹膜结构, 一侧用于气流通过, 另一侧用于培养液通过。中间多孔的PDMS膜两侧分别培养气管上皮细胞和血管内皮细胞, 从而达到模拟人体肺泡的气液界面的效果。肺芯片的两侧以循环抽真空方式拉扯PDMS膜,使细胞受到类似肺牵张作用, 模拟肺泡呼吸的效果。平面2D培养细胞存在难以有效模拟组织器官在体生理特性的缺陷。因此，用体外3D培养的类器官替代器官芯片中传统2D培养细胞就成为器官芯片技术进步的必然选择[37]。

       类器官芯片正是用三维(3D)细胞或类器官取代器官芯片中的二维(2D)细胞的方法推陈出新（相当于旧瓶装新酒）建立的新模型。采用嵌入水凝胶基质中的HepG2和NIH-3T3细胞的共培养物形成肝脏类器开发的药物筛选的微流控类器官芯片MODS，被成功用于不同浓度对乙酰氨基酚对细胞凋亡和坏死影响的药物早期肝毒性实验。研究显示，HepG2细胞和NIH-3T3细胞在水凝胶3D环境下培养，表现出成纤维细胞依赖性收缩行为，与同类2D细胞培养相比，白蛋白分泌谱和细胞色素P450 3A4活性更能好地模拟体内肝组织的功能状态[38]。

       与常规基于超低吸附表面的多孔细胞培养板实施的3D类器官培养模式比，类器官芯片依托微流控装置构建，流道、培养腔均为毫米尺度规格，可以控制单个细胞凝胶团运动，可让单个类器官的差异性研究成为可能，适合药物浓度梯度实验和不同对照实验，不仅大幅节省实验过程类器官和试剂材料用量[23]。而一个芯片上将多个培养腔集成，则成倍提高实验通量。而微流控技术控制细胞培养基、气体的输送供应，免除了类器官芯片的培养液定期更新的人工操作。最关键一点是，微流控控制模式，改善了传统静态类器官培养方式中营养代谢物交换扩散效率低下的问题，类器官随时处于稳定、可靠的培养条件中（正所谓：问渠哪得清如许，唯有源头活水来）。

       此外，在单一类器官芯片基础上，还可以将种类器官集成在一个芯片上，为设计开发多脏器类官芯片和人体仿真芯片成为可能[37]。

6）类器官组装体(Assembloid)

       类器官组装体是指将多个不同细胞类型构成或组织类型的类器官置入同一个培养体系实施共同培养生成具有复杂结构的复合型类器官，模拟体内真实器官的组织结构、发育特点。如一个脑类器官与一个肌肉类器官相连，以模拟肌肉组织的神经支配(innervation)。以肠道和胃类器官耦合以模拟消化道(gastrointestinal tract)。
        人脑类器官组装体是通过组装两个或更多脑区特异性类器官或将其他谱系细胞整合到脑类器官中而成的复杂结构，能够反映器官与器官或器官与细胞的相互作用，模拟更复杂的神经发育过程，作为研究神经回路的结构和功能的人源性模型，对深入理解神经精神疾病的发病机制以及开展药物筛选具有特殊价值[39]。研究人员用人源诱导性多能干细胞分别建立了大脑皮层、脊髓组织和骨骼肌的三种组织球体，以脊椎球体为中心将三种球体按皮质-脊髓-骨骼肌顺序相邻排列在培养皿中共培养后，三种球体逐渐融合并使自我精确组装，衍生出含大脑皮层、脊髓和骨骼肌的3D 皮质运动组合体[40]。
       用低浓度胆红素、抗坏血酸处理未成熟的类器官生成GLUL+肝细胞Z3-HLOs、CPS1+肝细胞的Z1-HLOs，将Z3-HLO和Z1-HLOs类器官按数量1:2的比例共培养生成带有三个细胞区带特征的组合式多区域人肝脏类器官(mZ-HLOs) [12]。

7）类器官异种嵌合体(interspecies Chimera)

       类器官嵌合体是将一个物种细胞生成的类器官人工植入到异种动物体内的研究模型。如将体外培养生成的人类器官移植到动物体内，以在模拟类器官生长发育依赖的组织微环境条件，以促进其进一步发育和生理整合，改善血管化形成和类器官的成熟度(maturation)。2022 年，研究人员突破性地实现了人类大脑类器官与大鼠大脑的连接，使得人类神经元与大鼠神经元的突触建立连接，并控制大鼠的行为[41]。在此基础上，将人脑类器官植入视觉皮质受损的大鼠脑部，不仅成功实现了人- 鼠脑的整合，并对视觉刺激产生反应，迈出了利用脑类器官修复受损大脑的第一步[42]。

       通过多能干细胞注射进行囊胚互补被认为是产生异种器官的最有前途的方法。但伦理规范限制了对胚胎发育晚期人类嵌合体的研究。灵长类动物胚胎干细胞具有与人ESC相似的多能性，是研究种间嵌合体和器官生成的良好模型。但灵长类动物ESC是否可用于异源性移植不清楚。中国科学院的研究团队采用一种优化的培养基，增强了食蟹猴 （Macaca fascicularis） 胚胎干细胞（cmESCs）的抗凋亡能力并改善了嵌合胚胎的发育，将驯化的食蟹猴（Macaca fascicularis）胚胎干细胞（cmESCs）注射到猪囊胚中所得的嵌合胚胎后，可分化成全部三个胚层的细胞。并在所得的新生异种间嵌合体观察到组织特异性cmESCs分化，表明cmESCs能够在猪模型中整合和分化为功能细胞。因此，类器官异种嵌合体展现了通过种间囊胚互补在大型动物模型中产生人体组织器官的技术可行性和再生医学技术发展应用的前景[43]。

三、类器官技术研究应用目前面临的主要困境

       盛名之下，其实难副。尽管类器官的研究和开发应用目前在科研和制药界如今可谓炙手可热，但类器官技术体系尚未完全成熟[25, 26, 32]。抛开构建类器官或类器官芯片的细胞来源、具体目标器官类型（组织类器官\类器官芯片\多器官芯片）、研究目的（基础研究\临床前研究\临床应用研究\生物生产）和类器官技术应用所涉及的伦理问题，还存在多个难题有待突破。

3.1 目前多数类器官对靶器官的还原程度还不够高

       在体的器官均是各种细胞类型的集合体，细胞与周围微环境之间存在多向相互作用，参与组织形成、维持稳态和功能稳定。而类器官培养体系中微环境相关细胞成分缺乏，类器官缺少有效的神经支配、毛细血管网络及相应的血管循环结构、免疫微环境，则难以完全重现各种器官的整体结构、细胞组成、真实器官所处生理环境和一些重要的生理过程[1]。常规类器官静态培养体系中，由于缺乏功能性循环系统，物质交换完全依赖物质在培养基质中的被动扩散而效率低下。随着类器官体积快速增长，营养物质和氧气向中心区域的扩散能力逐渐下降，中央区域细胞因物质交换不良而出现细胞坏死[26]。在1-3个月的类器官培养过程中，每2 – 3天需更换培养基、每5 – 7日安需传代1 次。尽管耗费大量人力实验材料，类器官内细胞的活力依然不足，类器官体积受限（大部分类器官尺寸为微米至毫米级，肿瘤类器官直径通常为100 ~ 500μm，3D悬浮培养中生长的脑类器官球体可以达到3-4mm直径），限制了类器官的结构与功能完整性、发育成熟度和类器官培养传代的稳定性[25,26]。

       为此，在大脑皮层类器官研究中，开发了切片新皮质类器官系统（sliced neocortical organoid system, SNO），将类器官置于带抗CO2振荡摇床的CO2培养箱或旋转生物反应器中培养，并与类器官切片方法相结合，以克服培养基物质交换扩散极限，SNO培养系统中的类器官可以维持长达一年，极大地促进大脑皮质类器官发育，特别适合人脑皮质发育和精神疾病中调节人类皮层神经元亚型命运的分子机制的研究[44]。

       而针对常规CO2静态培养条件体系中，采用多种细胞成分共培养的方法以重构体内的细胞微环境是较为流行的策略。如类器官与血管内皮细胞（endothelial cell，EC）共培养实现类器官血管化，可复制出与真实器官高度相似的内部环境。在超低吸附培养板中将血管内皮细胞、多能干细胞以及多能干细胞来源的肝内胚层细胞共培养，成功生成了具有自发血管网络的肝脏类器官，能更真实地反映肝脏类器官的发育或病理状态，为研究肝脏生理功能和疾病发生发展机制提供了新途径[45]。子宫内膜是一种多细胞组织，它包括构成子宫内膜表面的单层柱状上皮细胞和位于腔上皮下方的管状腺上皮组成。缺乏具有典型腔上皮样结构以及与体内子宫内膜解剖结构类似的体外模型，是深入研究不孕症和复发性流产、子宫内膜疾病等疾病的最大障碍。研究人员首先通过一系列实验优化上皮细胞和基质细胞共培养的最佳比例，并改善了培养类器官的细胞外基质，使之物理硬度及生理环境更利于子宫内膜细胞的生长发育，用气液界面培养方法（模拟体内子宫内膜腔面仅被黏液层覆盖的上皮结构的特殊体内环境），最终形成包含腔上皮、腺上皮及基质细胞的内膜类器官，准确再现了体内子宫内膜的细胞组成、解剖结构和月经周期性变化等特征^[18] 。

3.2 类器官的培养对非人源成分细胞外基质的依赖

       类器官实验技术实用化离不开培养试剂创新的产物。Matrigel是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜提取物。在室温条件下，Matrigel聚合形成具有一定孔隙和刚性的三维基质，可模拟体内细胞基底膜的组成结构、物理特性，为细胞粘附、细胞迁移提供机械支持形成稳定的组织结构，并介导细胞的迁移、定位、极化和信号传导。当前类器官培养中常用Matrigel 水凝胶，包含有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和包括TGF-ß、表皮生长因子、类胰岛素生长因子等在内的多种生长因子等。成份复杂 且具有批次间差异，导致类器官培养体系的不稳定。在处理培养基非人源成分和其他干扰因子的问题上，目前尚未找到非常有效的解决方法，给类器官标准化生产带来困难。化学合成的培养基质虽然可控性好，但生物活性低，难以用于不同类型细胞的共培养[26]。

3.3 最重要的是类器官构建技术标准体系不完善

       作为近10年来生物医学和临床医学最热门的前沿技术之一，类器官技术研究应用进展迅猛，人体多个器官均有其类器官的建立及应用的报道。

类器官构建操作流程涉及到组织样本前处理、原代细胞分离培养、干细胞重编程诱导、干细胞的分化培养、3D类器官培养、类器官传代扩增、低温贮藏与复苏等多个环节[46]。为确保产出的类器官模型的稳健性，从原代细胞、诱导多能干细胞和最终生成类器官，过程的关键节点需进行相应质量控制。最终生成的类器官，从形态结构、功能活性检测到表型表征分析。

       不同组织细胞来源的类器官（如肝脏、肠道、心脏等），培养方法等存在差异。目前，多数实验室条件下的类器官的培养主要依赖于主观经验和手工操作。诸如培养基和组成和更新频次、传代培养时机的把握、诱导分化过程中添加生长因子的种类和时机控制等，不同实验室构建的类器官模型间会存在差异。

       类器官虽能保留亲本组织的遗传特征和生物学功能，但长期传代、冷冻保存和复苏再培养对不同组织细胞分子特性的影响尚不十分明确。不同组织细胞诱导条件下的多能干细胞及所生成的类器官稳健性不一，而对生成类器官所用的多能干细胞传代代数目前并无统一标准。

       与相对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能。选择能准确反映类器官质量和功能的指标，以确定类器官在多大程度上还原了体内器官真实情况，并据此作为类器官质量评价标准，仍充满挑战性。一是因为不同种类的类器官功能不同，表征其结构、功能活性、生物标志物的检测方法与指标不同。二是不同实验室硬件资源配置不一，可利用的硬件条件参差不齐，给制定统一的类器官表征标准带来困难。

四、对类器官技术研究认识的误区

       类器官技术研究和应用目前正处于技术爆发阶段的阶段。研究成果报道及商业化应用宣传信息扑面而来，很容易让人陷入信息茧房。就我们所掌握的资料看，关于类器官技术研究应该避免以下认知误区。

       首先，类器官即人体类器官。

       事实上，目前公开实验报告中，衍生类器官所用初始组织细胞材料或构建成类器官，有相当部分研究项目与是啮齿类动物、鸡、家畜和灵长类动物等类器官有关。

       其次，类器官芯片先进论。

       须知，类器官模型芯片化主要目的之一是解决新药筛选对高通量的需求问题。并非所有组织细胞、类器官模型都已商品化，通过购买即可立即启动实验。以再生医学应用为目标的类器官研究，就难以通过类器官芯片的技术路线来实现。相反，目前大量公开报道中，无论是论文数量和文章质量和影响力，居支配地位的并非类器官芯片。

       再次，类器官自动化工作站万能论。

       类器官自动化工作站是集成了CO2培养环境控制模块、自动移液工作站、自动微孔板机械臂和倒置显微成像系统的一体式自动控制系统，通过个性化编程或基于预置应用协议，可实现从多能干细胞的诱导分化、培养期间自动移液和培养基更新、维持稳定的细胞培养环境，到微孔板细胞载体内类器官定期成像监测与分析全流程的自动实施。核心优势是能执行标准化的类器官培养协议，将实验人员从繁重操作中解放而可以把主要精力集中在实验目标与方案优化设计上。特别适合药物研发场景下测试目标较固定、实验方案标准化、有通量与效率要求的单线程实验。类器官培养实验耗时动辄数周甚至数月，自动工作站既不能缩短培养时间，也难以满足多个不同类型类器官共享一套系统同步的培养要求。类器官实验初学者，熟练实现实验流程编程绝非易事，而寄希望于自动化工作站实现walk-away式轻松工作，恐难如愿。

【参考文献】

[1] D5.1: Operational guidelines regarding organoids and organoid-related technologies (https://hybrida-project.eu/)

[2] Sato T, Vries R G, Snippert H J, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature, 2009, 459(7244): 262-265.

[3]   Spence J R, Mayhew C N, Rankin S A, et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature, 2011,470: 105–109.

[4]    Sato T, Stange D E, Ferrante M, et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology, 2011, 141: 1762–1772.

[5]    Eiraku M, Takata N, Ishibashi H, et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature, 2011, 472: 51–56.

[6]    Antonica F., Kasprzyk D.F., Opitz R., et al. Generation of Functional Thyroid from Embryonic Stem Cells. Nature. 2012;491:66–71.

[7]    Greggio C, De Franceschi F, Figueiredo-Larsen M, et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.Development, 2013, 140: 4452–4462.

[8]    Lancaster M A, Renner M, Martin C A, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature, 2013, 501: 373–379.

[9]    DeWard A D, Cramer J, Lagasse E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep, 2014, 9: 701–711.

[10] Chua C W, Shibata M, Lei M, et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nat Cell Biol, 2014, 16: 951–961.

[11]  Bartfeld S, Bayram T, van de Wetering M, et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology, 2015, 148: 126–136.

[12]  Reza, H.A., Santangelo, C., Iwasawa, K. et al. Multi-zonal liver organoids from human pluripotent stem cells. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-08850-1.

[13]  Huch M, Gehart H, van Boxtel R, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell, 2015, 160: 299–312

[14]  Takasato M, Er P X, Chiu H S, et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature, 2015, 526: 564–568.

[15]  Kessler M, Hoffmann K, Brinkmann V, et al. The notch and wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun, 2015, 6: 8989.

[16]  Maimets M, Rocchi C, Bron R, et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Rep, 2016, 6: 150–162.

[17]  Turco M Y, Gardner L, Hughes J, et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol, 2017, 19: 568–577.

[18]  Jiwen Tian, Jie Yang, Tingwei Chen, et al. Generation of Human Endometrial Assembloids with a Luminal Epithelium using Air–Liquid Interface Culture Methods. Adv Sci (Weinh)，2023;10(30):e2301868.]

[19]  Sachs N, de Ligt J, Kopper O, et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell, 2018, 172: 373–386.

[20] Sachs N, Papaspyropoulos A, Zomer-van Ommen D D, et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO J,2019;38(4):e100300.

[21]  Reiner A Wimmer, Alexandra Leopoldi, Martin Aichinger, et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 2019;565(7740):505-510.

[22]  Jiyoon Lee, Cyrus C Rabbani, Hongyu Gao, et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 2020;582(7812):399-404.

[23]  Lika Drakhlis, Santoshi Biswanath, Clara-Milena Farr, et al. Human heart forming organoids recapitucate early heart and foregut development.Nat Biotechnol. 2021 ;39(6):737-746.

[24]  Jonas Simon Fleck, Sophie Martina Johanna Jansen, Damian Wollny, et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids.Nature. 2023 Sep;621(7978):365-372.

[25] 王玥,施慧琳,靳晨琦,徐萍.类器官领域发展现状及展望.中国生物工程杂志，2023, 43(8):1-10

[26] 张冰也，吴羿霏，杜新. 类器官技术在新药研发中的应用. 药学进展，2023, 47(11): 849-863

[27] 傅丽霞,张秀莉,庞晓丛等.类器官和器官芯片在新药评价中的应用及国内外监管现状分析.中国临床药理学杂志,2023,39(18):2724-2730.

[28] Molong Qu, Liang Xiong, Yulin Lyu, et al.Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Res, 2021;31(3):259–271.

[29] Triebelhorn J, Cardon I, Kuffner K, et al. Induced neural progenitor cells and iPS-neurons from major depressive disorder patients show altered bioenergetics and electrophysiological properties. Mol Psychiatry, 2022;(29):1217–27.

[30] Avior Y, Ron S, Kroitorou D, Albeldas C, Lerner V, Corneo B, et al. Depression patient-derived cortical neurons reveal potential biomarkers for antidepressant response. Trans Psychiatry, 2021;(11):201-210

[31] Kaiqin Lu, Yuan Hong, Mengdan Tao, et al. Depressive patient‐derived GABA interneurons reveal abnormal neural activity associated with HTR2C. EMBO Mol Med, 2023; 15(1): e16364.

[32] 肖毅，吴名，姚刚.肿瘤类器官研究现状与展望. 中国癌症杂志,2024,34(8):763-776

[33] Jingjing Qu, Farhin Shaheed Kalyani, Li Liu, et al. Tumor organoids: synergistic applications, current challenges, and future prospects in cancer therapy. Cancer Commun (Lond), 2021;41(12):1331–1353.

[34] Bo Yuan, Xiaofang Zhao, Xiang Wang,et al. Patient‐derived organoids for personalized gallbladder cancer modelling and drug screening. Clin Transl Med, 2022;12(1):e678.

[35] Yue Shao, Jianping Fu. Engineering multiscale structural orders for high-fidelity embryoids and organoids. Cell Stem Cell, 2022;29(5):722–743.

[36] 器官芯片定义、分类及基底材料选择基本要求(T/CSBME 083-2024)

[37] 吴谦, 潘宇祥, 万浩, 等. 类器官芯片在生物医学中的研究进展. 科学通报, 2019, 64: 902–910

[38] Au S H, Chamberlain M D, Mahesh S, et al. Hepatic organoids for microfluidic drug screening. Lab Chip, 2014, 14: 3290–3299

[39] Shanshan Wu, Da Wang, Yan Liu. Brain assembloid: a human model for neural circuits research. Life Med, 2023;2(5):lnad031.

[41] Omer Revah, Felicity Gore, Kevin W Kelley, et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature, 2022;610(7931):319-326.

[42] Jgamadze D, Lim JT, Zhang Z, et al. Structural and functional integration of human forebrain organoids with the injured adult rat visual system. Cell Stem Cell, 2023,30: 137-52

[43] Rui Fu, Dawei Yu, Jilong Ren, et al. Domesticated cynomolgus monkey embryonic stem cells allow the generation of neonatal interspecies chimeric pigs. Protein Cell, 2020;11(2):97-107.

[44] Xuyu Qian, Yijing Su, Christopher D. Adam, et al. Sliced Human Cortical Organoids for Modeling Distinct Cortical Layer Formation. Cell Stem Cell, 2020; 26(5): 766–781.e9.

[45] Takebe T, Zhang RR, Koike H, et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nat Protoc, 2014, 9: 396-409

[46] Ruixin Yang, Yao Qi, Xiaoyan Zhang, et al. Living biobank: Standardization of organoid construction and challenges. Chin Med J, 2024;137(24):3050-3060.