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道妙休云所得迟——单细胞转录组测序分析在MSC应用研究中的价值与策略-上
细胞是生物体基本的结构和功能单位。由细胞产生、分布于细胞之间的非细胞形态物质称为细胞外基质(extracellular matrix, ECM)。众多形态相似、功能相关的细胞通过ECM连接构成组织。组织内各种细胞向ECM分泌各种功能活性生物大分子、细胞因子和代谢产物，共同构建起细胞群赖以生存的微环境(microenvironment)。微环境内的细胞，既彼此独立又相互依存、分工协作完成组织特异性生理功能。譬如骨髓间充质基质细胞(BM-MSCs),，作为“生态位细胞”，合成并分泌G-CSF、M-CSF、SCF、LIF、IL-6等多种造血细胞因子，构建起独特的骨髓造血微环境，可对造血干细胞(HSC)及其衍生祖细胞具有支持营养作用，维持HSC干性或诱导其分化，维持骨髓造血功能 [1-2] 。
对于体内单个细胞而言，微环境包括了围绕该单个细胞的同型或异型细胞，由细胞自分泌/内分泌及旁分泌作用而存在于细胞周围的细胞因子/激素及其他生物活性物质，辅助细胞与ECM的形貌及物理特性，机体运动或生理体液产生的机械力等多种微环境要素 [3] 。微环境除具有连接、支持、保护、营养、物质运输功能，还通过物理、化学或其他途径，直接或间接调控细胞的增殖、分化、代谢功能 [3] 。细胞对微环境中的各种组成要素（物理、化学和生物因素）变化的信号高度敏感，视组织类型与细胞类型而异发生功能与表型的改变 [4] 。譬如，在不同微环境下，曾命名为间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）的间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)，其外形、表面标志物、分泌活动、增殖与分化、迁移或粘附等会改变。细胞这种改变自身表型和功能的能力被称为可塑性(plasticity) [5] 。
可见，细胞与组织微环境之间的相互依赖和相互作用，赋予组织特定生理结构与功能的同时，也赋予各种类型细胞具有与所属组织功能相适应的表型 [4] 。因此，不同组织微环境差异，造成了MSC群体存在供体间及群体内异质性。内在异质性，加上从体内组织中分离、在体外培养条件下大规模体外扩增时的微环境压力，影响了MSCs群的组成与功能，或可部分解释基于MSCs的临床实验中常见的治疗效果不一致现象 [6] 。
一、关于MSC异质性的基本见解
MSCs研究已历经六十余年，要论与MSCs相关技术问题中争议最小的，恐怕非MSCs异质性（（heterogeneity））莫属。
即便以ISCT 2006年MSC标准定义的“均质”MSCs群内部，包括细胞大小、形态、增殖能力、分化潜能和免疫调节能力，仍然显示存在显著差异。MSCs异质性存在于不同组织来源MSCs、不同供体个体MSCs和不同MSCs克隆亚群之间以及MSCs克隆内部单细胞水平等多层面 [7] 。
1.1 不同组织来源MSC的异质性
对比人类骨髓来源（BM-MSCs）、脂肪组织来源（AT-MSCs）和脐带血来源MSCs（UCB-MSCs）显示，虽然不同组织来源MSCs在表面抗原表达、免疫抑制活性和分化能力上相似，但UCB-MSCs的细胞增殖率和克隆性最高，并且p53、p21和p16这些衰老标志物表达较低。在脂多糖（LPS）诱导的炎症条件下MSCs的抗炎活性研究显示，UCB-MSCs与LPS处理的大鼠肺泡巨噬细胞共培养，可降低包括IL-1α、IL-6和IL-8在内的炎性细胞因子的表达 [8] 。
1.2 同种组织不同供体来源MSC的异质性
大量研究表明，MSC群体存在供体间的异质性。对来自17位健康人体BM-MSCs分析显示，其生长速度、碱性磷酸酶水平和成骨潜能存在显著差异。从17名年龄在19-45岁之间的健康供体获取的髂后嵴骨髓穿刺液样本中分离BM-MSCs。首次传代的BM-MSCs在体外培养中的生长速率在不同供体间差异可达12倍。在不含任何成骨诱导剂条件下分别培养8天、22天时，不同供体间BM-MSCs群的碱性磷酸酶活性水平分别呈现40倍、10倍的差异。当暴露于成骨诱导培养基时，不同供体来源BM-MSCs群体在骨特异性基因诱导水平上表现出显著差异。表明BM-MSCs培养物由处于不同分化阶段、且具有不同成骨潜能的异质性细胞群组成。即使使用同一供体在6个月内多次采集的细胞样本建立培养体系，其细胞生长速率与ALP活性仍存在明显差异 [9] 。
1.3 同一MSC群内谱系分化潜力的异质性
人BM-MSCs群中最普遍克隆分化表型为成骨/成软骨/成脂三谱系、成骨/软骨双谱系和成骨单一谱系克隆 [10] 。研究表明，MSCs谱系分化命运遵循简单线性进程和具有层级结构特征，即三谱系克隆可产生分化潜能受限且频率可变的双谱系潜能祖细胞，而双谱系潜能祖体则衍生生长缓慢且仅限于单一谱系潜能的祖细胞。由原代MSCs克隆建立的次级克隆生长速率变化，正是因MSCs群内分化层级结构的不同所致 [11] 。对MSCs多向分化潜能评估发现，报道显示，其中约50%的BM-MSCs具有克隆扩张潜力，且其中仅50%克隆具有三谱系分化潜能，群体内近一半MSCs细胞分化潜能无法确定 [6] 。
1.4 同一MSC群内基因转录与蛋白表达异质性
譬如，MSCs群内快速增殖亚群高水平表达特定生长因子（如BMP2、FGF2、IGF1）、谱系标记物（如聚集蛋白聚糖、碱性磷酸酶、I型胶原、II型胶原）以及自我更新标记物（如SOX2）。相反，生长缓慢MSCs亚群的CD44表达水平更高。在成骨环境中，高分化潜能亚群更广泛地表达细胞外基质基因以及受成骨转录因子调控的基因。表达CD200的克隆为成骨细胞亚群，而表达SSEA4与CD140a的克隆为成脂细胞亚群 [7] 。
1.5 同一MSC群内细胞表型异质性
即使在单个克隆中，MSCs在细胞形态及分化能力方面亦存在差异。当集落暴露于成脂或成骨分化信号时，位于集落内部的细胞比位于外周区域的细胞更广泛地表达细胞外基质基因，而“外周”区域的细胞则表达与细胞增殖及有丝分裂相关的基因水平更高 [7] 。
越来越多研究发现，在使用现有细胞表面标志物定义MSCs时表现的组织间功能差异以及群体间异质性。而这种差异往往还与单一MSCs细胞亚群内细胞间异质性叠加而共同存在 [9] 。此外，在MSC培养和传代过程中，不同异质MSCs亚群之间的生长竞争和组成平衡关系会发生变化，某些亚群体比例下降甚至丧失，最终导致临床研究中细胞产品的功能表型和治疗结果的变异。
因此，对定义MSC异质性的分子机制的研究将促进亚型鉴定，阐明某种MSC亚型或不同亚型的组合是否能在细胞治疗和组织工程中展现有效性，并改进体外细胞分离和扩增的方法，有助于提升MSC产品的临床转化和治疗效果。
二、单细胞转录组测序视角下的MSCs表型异质性
单细胞转录组测序，即单细胞RNA测序技术(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)，是通过对组织样本中逐个细胞基因组转录产生的全部RNA产物定量检测，根据细胞转录水平上的异质性，构建细胞图谱、鉴定细胞亚群以及分析细胞的异质性。2009年，scRNA-seq被首次用于哺乳动物早期胚胎发育过程中不同干细胞亚群中单个细胞转录组的分析 [12]后。如今已成为胚胎和干细胞发育、类器官研究中的细胞组分类型、谱系分化、细胞功能状态和发育轨迹分析，稀有细胞类型鉴定，疾病标志性致病基因标记物分析中不可或缺的工具。近年来，采用scRNA-seq鉴定MSCs样品中功能性亚群和特异性表面标志物、各亚群间发育轨迹和功能特性等工作已取得显著进展。
2.1 不同组织来源MSCs功能异质性
原代人脐带华通氏胶间充质基质细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem/stromal cells, WJ-MSCs）和BM-MSCs两种样本，尽管细胞表面蛋白标记的表达显示 WJ-MSCs和BM-MSCs都是均一群体，但scRNA-Seq测试数据显示，两份样品共有436个显著差异表达基因，这些基因参与了包括免疫调节、血管生成、伤口愈合、凋亡、抗肿瘤活性和趋化等过程。与BM-MSCs相比，WJ-MSCs样品中免疫相关分子高表达。深入理解这两种组织细胞样本基因表达差异，可能有助于开发基于WJ-MSCs的新疗法 [13] 。
2.2 MSCs低培养代次内部细胞组成分群
譬如对BM-MSCs采用scRNA-seq技术研究项目 [14] 中，从健康供体骨髓中分离第1代MSCs，对经流式细胞分选（CD29+、CD44+和CD105+，CD14-、CD45-和HLA-DR-）获得的6998个细胞进行10X Genomics scRNA-seq分析。采用K-均值聚类法将细胞群划分为10个簇，簇1-9中细胞数分别为 1454个（20.78%）、1439个（20.56%）、1107个（15.82%）、931个（13.30%）、900个（12.86%）、734个（10.49%）、243个（3.47%）、154个（2.20%）、30个（0.43%）及6个（0.09%）。以CD14和CD163表达为特征的簇9、簇10为源自骨髓的单核细胞/巨噬细胞，具有截然不同的RNA表达谱及相对独立的定位分布。标记基因较少的簇1、簇3以及不含标记基因的簇7、簇8，为过渡性亚群。此外，簇2（高表达干细胞标志物SOX4、GAS1及DPP4在内）被预测为干细胞亚群；而簇4（其细胞因子及成骨/成脂因子表达阳性）则被鉴定为功能亚群。簇5、簇6 均表达增殖相关及细胞周期相关基因，被归为增殖性亚群1与2。
数据显示，经ISCT 2006版MSC定义标准方法鉴定的BM-MSCs一代培养物中，高表达干细胞标志物的细胞数量占比不到21%。这与既往报道中，BM-MSCs体外克隆中具有完整三谱系分化潜能的克隆数占比1/3的结果比较接近。表明从健康供体骨髓中分离第1代MSCs群，并非骨髓间充质干细胞的单一成份或以骨髓间充质干细胞为主体，而是具有转录特征、分化程度异质的细胞混合群，其中还混杂有少量造血谱系细胞。
MSC亚群通过GO与KEGG分析，识别出CD26干性亚群、CMKLR1功能亚群和增殖亚群三个亚群。第一类亚群CD26、SOX4和GAS1干细胞标记基因高表达，为干性亚群，其特异性标记基因在炎症反应、脂肪细胞分化、骨骼系统发育以及细胞周期负调控等通路中显著富集，表明该亚群具有维持干性特征及向多能性分化的特性。第二类亚群高表达CCL2和IGFBP2等大量细胞因子，为功能亚群，其标记基因与多种调控、炎症与免疫应答过程相关。第三类亚群表达与细胞周期相关基因表达，为增殖亚群并进一步分为G1/S期和G2/M期亚群，表明这两个增殖细胞簇在细胞周期中处于不同的阶段。CMKLR1功能亚群的CCL2、TGF-β、IGFBP2、PTX3、GREM1和CTGF等多种细胞因子表达水平远高于干性亚群，而这些因子与MSCs的免疫调节和多潜能分化能力相关。而功能实验显示CMKLR1功能亚群具有更强的免疫调节和成骨分化能力，但增殖和脂肪分化能力较低，说明功能亚群的功能比干性亚群更成熟。轨迹分支分析显示这三个亚群间存在明显的前后关系，其中CD26干性亚群是起始节点，可分化为CMKLR1功能亚群或增殖亚群。
2.3 同种组织、不同供体来源MSCs的细胞谱系构成情况
对相同传代次数下两组BM-MSCs样本的测序数据采用K-均值算法分析显示，不同供体BM-MSCs都包含干性亚群、功能亚群和增殖亚群，各亚群所占百分比几乎相等，且三种亚群比例在相同传代代次的MSC中也相似。不同供体BM-MSCs中大多数标记基因表达在两组MSCs样本各亚群中表达，只不过不同供体MSCs样本表达存在一定个体差异，可能与各自不同的功能相对应 [14] 。
2.4 不同传代次数MSCs群细胞谱系组成的变化
一般认为，随着MSCs体外培养持续传代，高传代后MSCs会因衰老而出现分化和迁移能力下降。BM-MSCs三种亚群中，干性亚群因不可逆地转变为功能亚群或增殖亚群，使得不同代次BM-MSCs样品内细胞构成出现动态变化。比较代次1 BM-MSCs（P1 BM-MSCs）和代次3 BM-MSCs(P3 BM-MSCs)的测序数据显示，CMKLR1功能亚群在P3 BM-MSCs中占比(62.5%)高于在P1 BM-MSCs中占比(37.4%)，并在P3 BM-MSCs中发现了一个新的亚群，其标记基因富集于氧化应激、内质网应激和自噬，这些生物过程被报道与MSC衰老相关。而功能实验显示，代P3 BM-MSCs在成骨分化和免疫调节活性方面略强。可见，BM-MSCs的功能主要取决于细胞群中各功能亚群细胞的实际组成比例，而非BM-MSCs的传代次数。直接分离CMKLR1功能亚群或促进干性亚群向功能亚群分化，可能在有助于提高BM-MSCs制品临床应用效力。
采用 CellRanger AGGR 分析工具对同一样本的P1 BM-MSCs、P3 BM-MSCss数据比对显示。与P1 BM-MSCs相比，P3 BM-MSCs中的功能亚群和过渡性亚群占比更高。相反，P1 BM-MSCs中增殖性亚群占主导地位。P1 BM-MSCs增殖率高于P3 BM-MSCs增殖率。P3 BM-MSCs的成骨分化能力优于P1 BM-MSCs，但成脂分化实验的结果相反。此外,该亚群与细胞氧化还原稳态、内质网应激、自噬以及生长负调控相关，提示该细胞簇可能为衰老亚群 [14] 。
