瀚海阑干百丈冰——从阿伦尼乌斯方程原理看组织类器官冷冻保存的解决方案-下

 （续：从阿伦尼乌斯方程原理看组织类器官低温冷冻保存的解决方案-上） 

三、组织细胞长期低温冷冻保存的技术解决方案

       综合看来，生物材料长期冷冻保存的温度应以稳定在不高于-132℃为宜，而液氮储存法和-150℃深低温冰箱储存法，在技术层面自然当之无愧。

3.1 传统液氮储存罐保存法

       液氮罐储存法是目前文献报道中普遍使用的生物组织低温保存手段。无论是器官、类器官、干细胞团块或单细胞胞悬液，采用平衡液平衡，经缓慢冷却降温或玻璃化处理后，通常会转入液氮环境下长期冷存。譬如，完整大鼠心脏用磁性冷冻保存剂（magnetic cryopreservation agents, mCPAs）灌注后，以mCPA作冷冻保存液，在程控降温仪内以15℃/min的降温速率完成玻璃化处理，最后在液氮（−196℃）中长期保存 ^[18] 。间充质干细胞形成的3D球体玻璃化保存流程中，球体先以平衡液（以含20% 胎牛血清的DPBS缓冲液添加1.4 M DMSO和1.4M EG配制而成）平衡10分钟，随后与玻璃化溶液（以LM5载体溶液添加0.3 M蔗糖、2.8 M DMSO、2.7 M EG、2.8 M甲酰胺及70 g/L PVP K12配制）混合1分钟，以每10个球体一管装入1.5 mL冻存管，直接浸于液氮中完成玻璃化处理并保存 [19] 。取1mL用CCM培养基制备、含 10% v/v DMSO的 Jurkat 细胞保存液，置于2mL 冷冻管中，用液氮程控降温仪以 1℃/min降温速率从4℃冷却至规定终点温度后，直接放入液氮中（-140℃以下）储存 ^[8] 。

       市面细胞保存用液氮罐，普遍支持液氮气相、液相存储。气相储存（Vapor Phase Storage）是指储存罐内液氮的液面低于冻存架最底层的高度并与保持一定距离，依靠底部液氮挥发产生的液氮蒸气冷冻样品。液氮液相储存（Liquid Phase Storage）则是将冻存架和样品直接浸没于液氮中，通过液氮与样品直接热交换将样品温度保持在-196℃，有利于组织细胞温度稳定。但多数情况下，细胞冻存采用的是液氮气相储存方式而非液相冷冻模式，主要是基于操作人员和样品安全考虑。Nalge Nunc International 公司与美国菌种保藏中心（ATCC) 2006年合作撰写的《样品低温保存技术手册》中指出，因市面普通旋盖冻存管的管身、管盖使用的是不同材料（譬如，管身为聚丙烯PP或透明聚碳酸酯PC材质，而管盖为PE材质），低温收缩速率不同。未经进一步密封防护处理而直接浸没在液氮，在降温过程中管身、管盖难免会产生微小缝隙而无法保持有效密封。一旦液氮渗入管内，除灰污染样品，但更大危险在于，在解冻复温操作中，管内液氮快速挥发造成压力积聚，可能会引起爆炸或生物危害因子释放，造成样品损失和实验人员伤害。

       所有大型液氮储存罐的内部空间，存在液氮蒸气温度不均问题。液氮液面处的温度介于-180℃~-196℃，而接近罐口的上部空间温度，往往与罐底部存在较大差异。特别是在频繁开盖、液氮补充不及时等特殊情况下，内部空间温差更大。研究报告中，可发现诸如玻璃化组织储存在-160℃液氮气相保存 ^[20] 、海藻酸盐封装的肝细胞球体(encapsulated liver cell spheroids, ELS)在液氮气相（～-170℃）储存 ^[5] 、Jurkat 细胞放入-140℃以下液氮储存 ^[21]等关于储存温度的描述。有报道指出，PBMC液氮气相存储装置中的温度可在-180℃至-150℃的范围波动，紧急情况下，温度还可能升至-130℃ ^[12] 。但总体上，只要气相储存期间最高温度不高于-132℃，可视为符合ISBER“最佳实践” ^[1]标准。

       事实上，在远低于相关系统玻璃化转变温度下（Tg≤-135℃）的液氮气相环境储存，是目前主细胞库和工作细胞库的公认和推荐做法 ^[22] 。

       YDS-145-216、YDS-175-216、Locator 4 Plus一类小型液氮储存罐，容量65-175L，液氮日静态蒸发率约1L。气相工作模式下，液氮装填量不到罐体容积1/3，内部液氮液面检测和液氮补充需全人工操作。新型Cryobin 3600、Cryobin 4800系列智能液气相储存氮罐，整合有全自动液位传感器监视、液氮自动补给功能，实现实时温度监控、液位监控、自动补液及监控数据自动储存功能，使储存维护管理负担极大减轻，工作可靠性增强，性价比高。而Thermo CryoExtra 20、HEco819P-190、YDD-460-320P这类大中型高效液氮气相储存罐，罐内底部气相平台下液氮容量50-130L，全自动温度、液氮补充管理功能，确保菌种、干细胞、组织器官等珍贵生物样本的气相储藏长期维持-150℃以下深低温。

3.2 -150℃深低温储存法

       当因工作场所条件限制或液氮供应问题，而无法使用液氮储存设备时，要将温度稳定在-140℃以下，-150℃深低温冰箱（Cryogenic Freezer）是一种可行的替代方案 ^[1] 。

       从人体捐献者采集外周血干细胞(peripheral blood stem cells, PBSCs)后，用含5% DMSO 和 6% HES组合冷冻保护剂的冷冻保存液，分别用四种不同方式进冷冻和保存：①在液氮中冷冻并存储；②在 -80℃冰箱中冷冻和存储；③-80℃冰箱冷冻后转入-135℃冰箱中存储；④在-135℃冰箱中冷冻存储。结果显示，样品在储存5年后，不同保存条件下样品的CFU-GM（粒-巨噬细胞集落）与TNC（有核细胞数）、细胞活力、CD34+ 细胞含量测定结果并无显著差异。表明，DMSO 和羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch, HES) 的组合冷冻保护剂方案，可依托-135℃冰箱实施冷冻存储 ^[3] 。

       另一种简单、高效的大规模灵长类胚胎干细胞玻璃冷冻保存方法流程是，①先将ES细胞先重悬于200μL DAP冷冻培养基（用CMK培养基添加2M DMSO，1M乙酰胺和3M丙二醇配制）中平衡，②再将样品转移到液氮中完成玻璃化处理，③最后储存于–150℃冰箱中 ^[23] 。

       另一项类器官保存方法研究中，以Eppendorf 管装载4个肾脏类器官，室温下先用200μL平衡溶液（以含谷氨酸的高级 RPMI添加10% DMSO、10% 乙二醇配制）浸泡8-15分钟，再用200μL玻璃化溶液浸泡处理10秒（以含谷氨酸的高级 RPMI添加20% DMSO、20% 乙二醇配制），样品管在液氮中冷冻10 秒后，可转移至-150℃冰箱储存 ^[24] 。结果显示，用-150℃冰箱执行的玻璃化冷冻保存法，在保持肾脏类器官的存活率、结构完整性和功能活性方面，与传统-160℃气相氮保存方法具有同等保存效力 ^[20] 。

表2 液氮气相储存罐、全自动液氮气相储存系统和深低温冰箱工作参数对比

       日本普和希MDF-C2156VAN、海尔DW-150W209的-150℃卧式深低温冰箱，采用深低温压缩机制冷，以常规市政电源供电，样品存取操作简便，无液氮补充管理负担。

       这类冰箱内部的工作容量约CryoExtra 20、YDD-460-320P、MGICLAB-LN55k Pro等中等容量液氮气相储存设备的一半，但工作能耗却与容量500L的TSX40086FA –ULTS、DW-86L579BPT这类-80℃立式变频节能超低温持平甚至更高。若以北京地区居民家庭用电计费标准测算，DW-150W209投产月电费开支，为MGICLAB-LN55k Pro自动液氮存储设备运行时氮气及电能消耗开支总和之4倍。折算成单位容积储存耗费后，深低温冰箱的储存成本，相当于液氮储存类设备的8倍之多。

3.3 全自动液氮自动储存系统

       全自动液氮储存系统，是近年来国内厂商在传统大中型智能液氮气相储存罐基础上，整合自动样品升降操作控制单元的封闭式样品存取新型液氮存储设备，可在低于玻璃化温度下进行生物样本全自动存取操作。

       系统内部分为密闭式-180℃稳定储存区、-150℃样品样品管分拣处理区。样品管提交至分拣区后，载入样品、自动转进/转出储存区。样品操作始终在低于-130℃的环境下进行，温度波动降低至最小程度。自动抓取机械臂，既支持单个8-13mm直径冻存管处理，也兼容主流SBS标准冻存盒及2 英寸方形冻存盒的整盒样品整存询价取、询价存整取等多操作。操作管理中，工作人员无需与液氮接触，避免人工操作失误，实现样品储存的安全、简便、高效。

       与常规小型液氮储存罐比，系统具有自动温度监测、自动液位检测和液氮补充管理功能。自动记录样本全储存周期数据、设备日志等信息，全流程运行记录可追溯，并可与第三方样本库管理系统对接，简化了平台管理操作。

四、小结

       从阿伦尼乌斯方程原理看， -150℃~-196℃保存环境无论是对低活化能的生化反应抑制能力，还是样品对管理维护期间的高温暴露抵抗力，都显著优于-80℃储存方案。

       目前，仍有不少实验室在使用-80℃超低温冰箱保存样品，究其原因，一是实验室资源配置所限，二是保存时间短，或几周至数月，或不超过1年半 ^[25] 。近年来，随着细胞治疗产品在临床应用开展，产品抵达患者之前常需经历跨省、跨州甚至跨国物流转运过程。限于目前物流冷链环节所能提供的-70℃干冰/-80℃低温条件，细胞在流转期间脱离最佳冷冻温度保护是难免的。为此，科研人员尝试通过优化细胞冷冻保存溶液配方，将样品玻璃化转变冷冻温度提升至-80℃以上，以确保样品在-80℃温度时保持玻璃化状态，有助于减轻产品因相对较高的冷链温度环境暴露所致的活性损伤。

       大量报道表明，液氮气相储存罐、-150℃深低温冰箱可作为组织、干细胞及类器官等生物活性材料的长期保存的有效性和稳定性。值得注意的是，在日常样品存取操作期间，应尽量避免样品从液氮中移除后在室温下的高频次、长时间暴露。条件允许情况下，新型自动液氮储存系统可减少样本库长期保存样品的温度波动风险，无疑值得关注。

       -150℃深低温冰箱，工作稳定性高，无需液氮工作，工作场所适应性好，管理维护简便。是液氮供应困难及较封闭实验场地情况下，替代液氮储存方式的可靠方案。

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