瀚海阑干百丈冰——从阿伦尼乌斯方程原理看组织类器官冷冻保存解决方案-上

       冷冻保存（cryopreservation）是指通过将经过冷冻保护的活体细胞或完整组织、器官及生物体置于超低温环境（通常为液氮或其蒸气中，最低温度可达-196℃）进行保存。其目的是通过样本的冷却有效抑制包括可致细胞死亡的生化反应在内所有生物活动 ^[1] 。常用的冷冻保存方式分为不可控或可编程受控速率缓慢冷却保存法（Controlled-rate cooling）、玻璃化保存法（vitrification）两种（见《玻璃化技术在生物样本低温保存中的应用原理及实施方法》）。

       在温度低至-196℃环境下，样品降解反应几乎停止，可稳定储存长达几个世纪 ^[2] 。国际生物与环境储存库学会（International Society for Biological and Environmental Repositories, ISBER）2012年颁布的《研究用生物材料收集、存储、检索和分发存储库最佳实践》中将Mazur给出的水玻璃化转变温度(glass transition temperature of water, GTTW)，即-132℃，作为所有生物活性停止的临界值。对样品应储存在液氮气相（约-150℃）或液氮液相（约 -196℃）的选择，推荐气相储存模式。不仅因液氮气相温度足以保持样品温度低于GTTW临界值，还有避免液相储存固有安全风险的考量。

       然而，实际工作和文献报道中，在-80℃超低温冰箱中储存生物样本的情况确实存在 ^[3-5] 。所以，有必要澄清，到底组织细胞能否在-80℃超低温冰箱环境中长期稳定储存这一问题。

一、阿伦尼乌斯方程原理对低温冷冻保存温度制定的指导意义

       1889年，瑞典物理化学家，1903年诺贝尔化学奖获得者S·A·阿伦尼乌斯(Svante August Arrhenius, 1859-1927)，基于电解质在水溶液中电离的大量实验证据，得出化学反应速率常数与反应温度之间的定量关系式——阿伦尼乌斯方程（Arrhenius Equation），以描述温度（T）、活化能（Activation energy, Ea）与反应速率常数（k）间的关系。

K=Ae^((-Ea)/RT)  ………………………………………①

       公式①被称二常数公式或二元线性回归方程。低温生物学关注的是常规室温（+20℃~27℃）至-196℃温度范围（77K~300K）、细胞内部体相水中因分子或粒子间随机碰撞引发的生化反应，这就为用阿伦尼乌斯二常数方程定律理解生命活动反应过程提供了便利。

       式中A为给定反应的特征常数，e为自然对数的底数（2.718），R为气体常数（8.314 kj/mol），T为热力学绝对温度，单位为开(K)。

       k与T呈指数关系，温度T的变化对速率常数k影响巨大。对于给定的化学反应，温度升高，则k值变大，反应速率加快；反之，则反应速率减慢。这是因为，温度升高时，反应物分子的能量增加，大量非活化分子获得能量转变成活化分子，体系中活化分子百分比增加后，分子间有效碰撞次数增多，反应速率相应加快。

       对生命活动过程中相关生物化学反应而言，样品温度低，则k值低，反应速率缓慢。将组织细胞的温度从193K（-80℃）、123K（-150℃）降低至93K（-180℃）时，所有反应过程的反应速率依次降低直至完全停滞。为最大程度降低各种代谢、酶解、催化、应激损伤发生，提高细胞存活率和功能活性，细胞冷冻保存的温度自然是越低越有利，选择液氮-196℃储存正是基于这一考虑。

       Ea为反应的活化能，可理解为由非活化分子转变为活化分子过程对应的能量值，代表一个化学反应反应发生所需最小能量，单位是千焦耳/摩尔（kJ/mol）。Ea 位于Arrhenius公式的指数项, 因此Ea数值的改变, 对化学反应速率常数k有极大的影响。常温条件下，Ea每改变5.7kJ /mol， k值变化将达到一个数量级 ^[6] 。Ea 的大小由反应物分子性质决定，与分子的内部结构密切相关，通常不随温度改变。普通化学反应的Ea一般介于40–400 kJ/mol区间。Ea小于83.14 kJ/mol的反应为快反应，Ea大于120 kJ/mol者为慢反应。人们通常研究的化学反应的活化能多数分布在80–120 kJ/∙mol的范围内 ^[7] 。

       在相同温度下，某一化学反应过程Ea小，则反应速率常数k大，不仅代表反应速率快，还意味着反应更容易维持。而Ea大的反应进程，对活化分子浓度、温度等条件要求高，反应速率慢。

       冷冻冷冻保存过程中细胞损伤与死亡的易发、高发现象足以说明，DMSO等渗透性冷冻保护剂的毒性反应、渗透压应激、氧化应激、膜损伤等各种病理性生化反应通路激活所需的Ea，可能低于激活管家基因表达、蛋白翻译后修饰、DNA复制增殖、细胞增殖等维持细胞正常生命活动反应通路的Ea。而低温保存的细胞，随着温度升高，首先激活的生化反应必定是如带电粒子的结合、氧自由基毒性反应这类对温度、自由水分子需求依赖较低反应通路，其次才是诸如能量代谢、基因转录、蛋白翻译与修饰等对酶活性、底物、水分子、PH环境、温度等条件有一定要求的生化反应通路激活。因此，组织细胞长期保存温度的选择上，理应是以低为先，将一切易发性有害反应通路在其萌芽阶段予以阻断。

1.1 对组织细胞玻璃化转变温度的认识

       在冷却温度达到-123℃之前，样品内部发生玻璃化转变，因玻璃物质热传导性能限制，仍会有少量水、DMSO 、离子物质和代谢物等溶质存在于细胞内玻璃结构的孔隙内，Ea能值低的理化反应仍可能在胞内或在细胞外区室和细胞膜之间的局部发生。当细胞内温度降低至玻璃化转变温度(Tg)以下，即低于 -123℃时，样品内部彻底完成玻璃化转变后，细胞内容物粘度高达10 trillion Poise，水因凝固丧失了流动性 ^[8] 。水分子扩散限制，各种生物、化学反应过程的底物传输、相互碰撞、分子构象改变等通通受阻，甚至连盐离子积聚、小分子代谢物扩散都已停滞。此时，方可视为达到维持细胞功能与结构完整性所需的持久稳定理想条件。

       体相水的玻璃化转变温度值及在Tg时的水分子运动已讨论数十年。马祖尔提出，体相水的玻璃化转变温度为-132℃ ^[9] 。而实际工作中所适用的细胞冷冻保存液，通常是在细胞培养基中添加CPA以及细胞抗氧自由基、抗凋亡保护性等多种组分配制的。故各种细胞保存液的玻璃化转变温度比纯水GTTW要高，Tg介于-40℃~-125℃都有报道。

       事实上，玻璃化处理所约束的对象并不仅是溶液中的、细胞内部可流动体相水(bulk water)，还应包括生物大分子结构、细胞组分内部纳米尺度孔隙中的受限水（confined water）。譬如，蛋白质结构内部间狭小的间隙中的水分子，其存在与蛋白质的结构和功能以及蛋白组装等有关。由于水分子与界面之间的相互作用，受限水晶相的变化和相变的热力学性质与体相水有较大的差异。分子尺度下的固液界面作用，增大水传输的驱动力，提高了水的输运效率 ^[10] 。研究表明，纳米空间尺度内的受限水，在-103℃（170K）~-73℃（200K）温度区间发生玻璃化转变，具体温度取决于受限尺寸及与壁面的相互作用 ^[11] 。

       综合来看，细胞内部体相水因含有大量溶质，特别是CPA和蛋白质，粘度高，玻璃化转变温度相对较高（高于-70℃）。但纳米空间的受限水，其玻璃化温度相对较低，加之溶液、细胞内容物热传导问题，并没有同步完成玻璃化转变。胞内大量纳米孔隙的受限水依然处于液态，小分子化合物、粒子具有功能活性可能。以含10% DMSO的Jurkat细胞冷冻保存液为例，先以1℃/min的缓慢速率冷却至-80℃，后再转入液氮中保存。在冷却过程中形成的细胞内玻璃化(intracellular glass transition, Tg'i) 结构时，观察发现，水分子、离子物质等溶质仍可在玻璃态结构孔隙中迁移。当低于 -123℃时玻璃化状态才能实现持续稳定。这一结论不仅对Jurkat细胞有效，同样适用于他DMSO保存时具有相似的物理特性的其它培养细胞系的保存处理 ^[8] 。

       因此，采用-103℃或更低的-123℃低温环境，对于细胞内部实现全面持久的玻璃化转变，有积极意义。

1.2 对生物组细胞材料低温冷冻保存温度的生物学考虑

       已有大量关于-70℃/-80℃的超低温温度环境暴露对细胞存活率、细胞功能不利影响的报道。

       譬如，关于贮藏温度对外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）基因表达影响的研究中，PBMC被分装成4个相同体积样本(Sister aliquots)，一个作为新鲜组织对照，其余三个则分别在三种不同温度条件下储存：(1)气相液氮中静态储存于−150℃，(2)模拟长期存储中队样品分拣处理场景条件，在−80℃与−150℃之间循环（起始温度−150℃；以+10℃/分钟升温至−80℃；保持−80℃ 10分钟；以−30℃/分钟降温至−150℃；保持−150℃ 10分钟；每日循环处理8小时持续13天；最终转移至液氮气相储存）；(3)静态−80℃超低温冰箱储存。

       采用 AnnV/7-AAD方法测定PBMC细胞活力的结果显示，持续储存在≤ −150℃和执行−150℃/-80℃热循环处理的样本间没有差异，而−80℃下储存样品凋亡/坏死显著增加。在 ≤ −150℃储存的PBMC恢复率和存活率优于−80℃储存样品。

       对新鲜和三种不同储存条件下PBMC的基因表达分析，共有1367个基因表现出表达增加或减少超过3倍的变化。与始终保持 ≤ −150℃储存的PBMC比，PBMC经历热循环处理后的基因表达无显著变化。但观察到有18个基因表达变法只存在−80℃保存样品组中。有66个基因分布与在2个或多个主要与应激相关细胞信号通路中，可能与氧化应激(oxidative stress)、渗透压应激(osmotic stress)、膜损伤(membrane disruption)以及热或冷休克(heat or cold shock)等多种应激刺激反应有关。而经实时荧光定量PCR、微阵列相互验证的13个基因中， 5个基因表达下调，其余8个基因表达显著上调，被认为参与干扰素信号通路、细胞死亡相关通路、免疫调节通路及MAPK信号通路。另外，在−80℃保存的样本中，冷冻保存30天后即可检测到gH2AX ser139蛋白阳性，表明冷冻保存的细胞中可能发生DNA双链断裂（double-stranded breaks, DSB）和随后激活DNA修复机制。分析DNA损伤可能与解冻后PBMC凋亡/坏死增加有关 ^[12] 。

       可用于急性肝功能衰竭治疗的藻酸盐包裹肝细胞球体（ELS），其冷冻保存储温度和有效保存时间，直接影响生产成本和临床应用便利性。对分别存储在−80℃或−170℃、储存时间1、2、3、6、9或12个月的ELS样品，在复温24小时后的功能活性恢复情况评估显示。在−170℃存储条件下不同保存时长的ELS，存活细胞数及功能均维持在相似水平。但−80℃储存的ELS，在短短1个月内便显示出活力、存活细胞数及功能下降，并随储存时间延长观察到逐步恶化的趋势。存储12个月后，−80℃环境下ELS的可存活细胞恢复率仅为−170℃存储的15% ^[5] 。

       另一项研究发现，在液氮中冷冻保存的肝细胞球体的存活率与新鲜原代肝细胞球体相当，但在-80℃超低温冰箱保存后样品，肝功能活性明显下降。与液氮冷冻保存组相比，将球体水凝胶微球在超低温冰箱中冷冻保存导致氨清除率和尿素分泌率均显著下降（约30%）。注入BAL系统生物反应器运行24小时后，由液氮冷冻保存的肝细胞球体，解冻后生成的水凝胶微球组的肝功能活性更高。无论冷冻保存时间多长，在液氮中保存的肝细胞球体的氨去除率或尿素分泌率均无统计学显著差异。而-80℃保存的肝细胞球体的肝功能活性明显较低，氨去除率和尿素分泌率比液氮冷冻组下降了30% ^[13] 。分析指出，组织、细胞保存时长超过1个月时，应避免使用−80℃超低温冰箱方案。

       大量报道说明，低于-150℃的液氮储存方案，在维持细胞功能活性、降低细胞死亡率方面极为必要。

二、从阿伦尼乌斯方程反应速度常数看细胞冷冻保存期间温度波动问题

       对阿伦尼乌斯二元常数公式取对数后，得到公式②：

lnk = lnA-Ea/RT  ………………………………………②

       若已知反应在温度T1、T2的速率常数分别为k1、k2，则有：

lnk_=lnA-Ea/(RT1 )   ………………………………………③

lnk2=lnA-Ea/(RT2 )  ………………………………………④

       将③、④相减得到公式⑤：

ln k1/k2 =-Ea/R(1/T1 -1/T2 )  ………………………………………⑤

       公式⑤可转换为指数形式，得到公式⑥：

k1/k2 =e^(E_a/R((T2-T1)/(T1.T2)))  ………………………………………⑥

       根据公式⑥可知：

       对同一反应，温度波动幅度（T1-T2）相同时，高温区段时T1·T2值大，而k1/k2小，两种温度条件下反应速率接近；而低温区段，T1·T2值小，k值增大倍数大，说明反应速率变化更显著，既反映在此温度区间对对温度波动更为敏感。譬如，某一反应中，样品温度(T)波动是93K（-180℃）→113K（-160℃），而另一次操作温度(T’)波动为193K（-80℃）→213K（-60℃），则根据公式⑥，得到表1计算结果。

表1 温度波动与化学反应速率常数变化

       数据表明，样品温度上升幅度均为30K，高低温间化学反应速率常数的提升倍数值K2/k1，在深低温区高于超低温区。假设Ea=83.14 kJ/mol，则深低温区速率常数变化为超低温区常数的7.4-20倍。虽然深低温区化学反应速率整体处于低位或处于抑制状态，但一旦达到反应活化能阈值，反应激活后会以更快加速度进行。

       表1还显示，反应体系温度波动幅度大，则反应速度常数提升倍数（K2/k1）大。

       为了能将氧自由基损伤、渗透压应激等可在低温环境下进行的生化反应遏止，应尽可地将储存温度保持在较低水平。同时，还应减少样品操作管理期间高温暴露时间，以减少样品温度波动幅度。

2.1 组织细胞低温冷冻保存期间存在的温度波动现象

       按国际生物与环境储存库学会2012年版的《研究用生物材料收集、存储、检索和分发存储库最佳实践》指南要求，维持解冻后最好的维持细胞活性和功能，应将样品温度稳定维持在−132℃以下。液氮温度在通常实验条件下是恒定的，故在液氮中长期存储生物材料是目前最常用、最可靠的方法。然而，即便在现代生物样本库技术条件下，样品转入液氮罐、样品储存、样品分类和样品取出过程中，可能出现温度波动。此外，由于存储位置变动、物流运输、样本库设施设备维护操作原因，无法确保样品的整个生命周期内储存在 -132℃ 以下。

       资料显示，液氮气相存储装置中的温度波动范围可在 -180℃至-150℃之间。紧急情况下，设备内部的温度会上升至-130℃。据报道，常规室温环境下，储存在−150℃的液氮蒸气或-150℃深低温冰箱的样本取出后，仅需4分钟就样本温度会飙升至−132℃ ^[12] 。视室温和样品高温暴露持续时间不同，将样本重新放回液氮蒸气或深低温冰箱后，需数分钟~3小时，才能让冻存管内部恢复到取出前的储存温度 ^[15] 。

2.2 组织细胞冷冻保存期间温度波动问题的负面影响

       关于生物材料长期存储期间反复的温度波动变化对样品潜在损伤问题，目前还缺乏足够系统的研究和数据信息。但即有资料表明，频繁而大幅样品温度波动，对细胞存活率、恢复率及功能性的存在不利影响。了解这些数据，有助于为实验室和生物库在储存与样本管理方面的决策提供参考。

       德国Fraunhofer生物医学工程研究所的研究人员通过模拟样品管理过程中三种不同操作模式，比较了样本存储、样本分选和取出过程中重复温度波动对外周血单核细胞（PBMC）健康的影响。

       ①液氮恒温保存模式：PBMC在液氮气相罐中恒温储存（作为对照）。

       ②样品-80℃暴露循环模式：从液氮中取出后，在-80℃保护罩内平衡约5分钟，至样品温度上升至-102℃后，重新返回液氮罐中，待样品温度恢复至液氮保存温度后，执行新一轮升温操作，共进行400次循环。

       ③样品+20℃暴露循环模式：从液氮中取出后，在20℃室温下平衡约5分钟，至样品温度升至-60℃后重新返回液氮罐中，待样品温度恢复至液氮保存温度后，执行新一轮升温操作，共进行400次循环。

       结果显示，与无温度变化的液氮恒温储存样品比，周期性温度循环波动可降低细胞活性、恢复率及针对特定抗原的免疫反应。这暗示了由样品储存中分拣和存取操作所引起的多次温度变化，会降低 PBMC 的回收率和存活率（台盼蓝排斥法）以及 T 细胞功能（IFN-γ ELISpot 测定），并会增加解冻细胞培养过夜后死亡细胞 ^[16] 。

       另一项针对冷冻保存温度波动对PBMC影响评估实验，采用了三种不同储存条件：①≤-150℃恒温储存模式；②先在≤-150℃下储存24 h，后由受控升温至-80℃，最后返回液氮中保存的三步热循环操作，重复进行104次。总计52 小时热循环过程中，每次在−80℃ 下维持10分钟，104个循环的总−80℃ 暴露时长累计17.3 小时；③储存在-80℃超低温冰箱中。用 AnnV/7-AAD测试得到的PBMC细胞活力数据表明，液氮恒温储存、液氮与80℃循环处理两种样本间细胞存活率、基因表达变化模式基本一致。但−80℃下恒温保存样细胞凋亡/坏死增加。分析还指出，导致细胞损伤并非循环次数，也非从-150℃到-80℃间温度循环或在较高温度下暴露的累积时长，而是持续的-80℃高温暴露所致 ^[12] 。

       低温储存过程中温度波动对胎盘间充质干细胞（MSC）状态的影响评估实验中，将样本从液氮冷冻储存罐中取出，在20℃室温下暴露，使样品样品温度分别提升至-80℃、-100℃和-150℃后，立即浸入液氮恢复至-196℃，然后再提取出来进行下一轮升温循环操作。每种测试终点温度暴露操作各重复次数5、10、20、30、40 和 50 次后，结果显示，与液氮恒温储存相比，-196℃~-100℃温度循环进行不超过20个循环时组内MSC存活率和代谢参数屋显著差异。但增加-196℃~-100℃温度循环次数、-196℃~-80℃循环组的这两个指标会显著降低，且凋亡变化的数量会随着温度波动循环次数增加而增加。此外，经历温度波动的样本中，出现细胞解冻后的附着能力受损现象 ^[17] 。

       上述研究结果提示，入库冻存样品在分拣、提取和样品转运期间，应采取必要防护措施，减少较高温度、室温下的操作暴露次数和暴露持续时间，以确保样品储存安全平稳。

（后续：从阿伦尼乌斯方程原理看组织类器官冷冻保存的解决方案-下）