Thermo Forma 311、371GPCN及3111 CO2培养箱日常清洁维护要点

       美国联邦标准209E标准采用以每立方米（每立方英尺）空气中所含有最大允许微粒子数量来确定洁净室和洁净区的空气洁净度的分级方法，将洁净室和洁净区的空气质量划分为Class 1级、10级、100级、1000级、1万级、10万级六个等级。这里的“级”数表示每立方英尺空气中含有0.5μm或更大微粒的最大允许数。如Class 100，代表在每立方英尺空气中允许≥0.5µm的颗粒数不超过100个。以下是科研及工业生产常见应用环境下室内空气洁净度的等级控制要求。

       国际标准ISO 14644-1空气质量标准则设有ISO Class 1-Class 9共9级。其中，ISO Class 5级对应于美联邦标准209E的Class 100级，代表1m3空气中含有0.5μm的灰尘颗粒数为3520个。ISO Class 6级对应于美联邦标准209E的1000级，代表1m3空气所含的0.5μm的灰尘颗粒数为35200个，以此类推。

       我国《GB/T 42398-2023 细胞培养洁净室设计技术规范》规定，小型细胞培养室应至少设置有洁净间（空气悬浮粒子浓度受控并分级的房间）、洁净区(洁净间内进行关键工艺、操作的特定空间，如超净台、生物安全柜、培养箱等)、辅助区（在洁净间外，有一定洁净度要求以保证洁净间空气洁净度稳定性，为洁净间做相应准备、服务工作的区域）和缓冲区（辅助区内与无洁净度要求空间之间可供人员自由通行区域。在保证工艺要求的情况下，可将辅助区和缓冲区合并）。不同工作区的空气洁净度要求为：

       不同工作分区空气中微生物含量的控制标准为：

       浮游菌是指通过浮游菌采样器收集悬浮在空气中的活微生物粒子，通过专门培养基在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数，单位是cfu/m3。沉降菌是指通过被动式采样法收集到的悬浮在空气中的活微生物。

       上述标准的内容表明，不仅是洁净间内开放式操作区、洁净间外辅助区存在浮尘、细菌颗粒物，就连正常工作状态下的CO2细胞培箱、超净工作台和实验常用二级生物安全柜的内部，都难以有效杜绝尘埃和微生物颗粒物的出现。而尘埃和微生物颗粒可通过实验室内的空气流动而传播。每次打开CO2培养箱门时，污染物都有可能随对流气体进入箱内。而高温、高湿度环境下，吸附于培养箱内部各组件表面的各种微生物很容易滋生繁殖和扩散，污染培养容器外表面，进而引发细胞样品的污染风险。因此，定期清洁对于保护细胞免受污染以及保持培养箱正常运行是必要的。

       此外，长期缺乏维护清理的室内空调管道内可能滋生有霉菌。因此，应尽量避免空调出风口吹向培养箱，或调整培养箱安装方向，以减少外部气流携带室内空气污染物进入箱体。

一、对培养箱内腔消毒(Disinfecting)

       美国赛默飞技术专家Mary Kay Bates在2016年编撰“Best Practices for CO2 Incubator Maintenance”（二氧化碳培养箱维护的最佳实践）中给出的建议是：

1）每周检查一次培养箱，丢弃未使用的培养物；

2）及时清理所有溢出的培养物；

3）每月清洁培养箱一至两次（视使用人数而定）；

4）清洁方法：无需对所有物件高压灭菌，可用70%乙醇喷洒或擦拭培养箱（注意不要让乙醇喷到传感器上），晾干即可。70%的酒精溶液易挥发和易燃，只能在通风良好且没有明火的区域使用。

       对已投入使用的设备，首先应断开设备与电源连接，关闭所有气体调节器，待设备完全冷却后再进行后续处置。

①拆卸内部组件：搁板组件（搁板和搁板固定支架）、HEPA过滤器（工厂预装）、箱体后壁空气入口过滤器（access port filter）、CO2气体过滤器（sample air filter）、左右导管板及顶部导管（top duct）。拆卸顶部导管时需先拆卸两个可手拧的翼形螺母（wing nuts）。

② 用消毒剂清洗搁板组件、导管、翼形螺母和塞子（stopper）。搁板支架、导管等表明不规整、不便于喷淋清理处理的部件，可进行高压蒸汽灭菌处理。

③拧下CO2气体输入风机固定螺丝，拆下风机叶轮和检修口滤网，用消毒剂清洗干净。

④松开CO2传感器周围的固定环，将CO2传感器降下，即可移除、清洁和更换传感器垫片。用喷有 70% 乙醇的无纺布/纸小心擦拭CO2传感器外部即可。警告：请勿用易燃溶液喷洒T/C CO2传感器。

因为当设备运行时，传感器内部温度高达150℃，故清洁工作应在主机断电停机，待T/C传感器充分冷却后才能进行。

⑤拆卸内门密封条（inner door gasket），用消毒剂清洗密封条缝隙中的污垢。

⑥用消毒剂从上至下清洗箱体内部后，再以无菌水冲洗以完全清除残留消毒剂。清洗完毕，用70%酒精喷洒消毒。

⑦如CO2传感器垫圈被移除，请用70%酒精喷洒并重新安装。

⑧安装新HEPA过滤器。

⑨ 安装搁板组件并喷洒70%酒精。

       在重新重新启动前，让箱门半开风干内部，检查是否没有残留酒精味。如果在内部仍处于潮湿状态时打开电源，O2 和 CO2 传感器可能会损坏。

⑩ 增湿盘（Humidity Pan）清洁维护

       建议每月定期细致清洗增湿盘，防止微生物滋生和水垢沉积。

       清洗时，先用实验室消毒剂清洁增湿盘，再以无菌水冲洗，并喷洒70%酒精消毒或进行高压灭菌处理后再放回培养箱内。

增湿盘用水的选择：不可用市政自来水（含少量氯的自来水可能腐蚀不锈钢，并且水中可能含有细菌和矿物质）、去离子水或一级超纯水（具有极强的腐蚀性）、反渗透水（水质可能差异很大）作为增湿盘蒸发水源。最佳方案是使用pH值在7.0-9.0的无菌蒸馏水。

       至少每两周换一次水（不仅仅是补充水量，而是彻底排空增湿盘后重新加入新鲜蒸馏水）。

⑾ 清洁玻璃门

       箱体玻璃门和可选的独立内玻璃门可使用与培养箱内部相同的消毒剂进行清洁。必须用无菌蒸馏水冲洗，以去除消毒剂残留。然后用软布擦干。

培养箱玻璃门清洁与维护注意事项：使用pH值高于9的清洁化学品并加热（高压灭菌）会加速玻璃的腐蚀过程。因此，清洁后必须彻底冲洗并晾干玻璃门，应避免对玻璃门进行高压灭菌。对于发生腐蚀玻璃，大多数情况下必须更换。

⑿ CO2培养箱清洁消毒剂的选择

       市面上有多种消毒剂，但并非所有消毒剂对细胞都是安全的。一些强效消毒剂会释放气体进入培养箱，从而影响细胞生长。避免使用含氯清洁剂（含氯漂白剂及其具有氧化活性的衍生物会腐蚀不锈钢，并对培养的细胞有毒）、强碱性、腐蚀性试剂。

       70%乙醇是最容易取得的常用消毒剂。此外，赛默飞官方还推荐使用季铵盐类消毒剂。季铵盐类消毒剂（Quaternary Ammonium Disinfectant）是以氯型季铵盐或溴型季铵盐为主要杀菌有效成分的消毒剂，不会对培养箱组件有腐蚀作用，而且作为杀菌剂，对多种微生物广谱有效，早已被广泛用作医疗器械、食品加工设备的洗净杀菌剂以及配制有杀菌功能的洗涤产品。赛默飞世尔科技的技术团队测试表明，2%季铵盐消毒剂溶液可直接加入到增湿盘中使用。

       用消毒剂将所有待消毒的物品表面彻底清洁后，并用无菌水冲洗，待干燥后即可再使用。

二、箱体外表面的清洁

       Best Practices for CO2 Incubator Maintenance”建议，移除放在培养箱顶部的所有物品，每两周清洁一次顶部以去除灰尘。

       使用清水浸湿无绒布（lint-free cloth）清洁箱体外表（控制面板除外）两次后，再用干净的布擦干。对于箱体门把手，可用70%乙醇擦拭后，再以干净清洁布擦干。

       注意：请勿对仪器控制面板使用任何液体（包括喷雾清洁剂）擦拭。该部位应使用干无绒布清洁即可。

三、气体过滤器更换的更换

       Thermo ScientificCO2培养箱内置HEPA 过滤器和清洁套件有助于确保空气质量表现达到可测定的 100 级。通常建议，根据用户数量、设备清洁度以及实验室空气洁净程度，每6-12个月，或根据使用环境，定期更换进气口和排气口的HEPA或微生物过滤器，以保证箱内洁净的培养环境。

3.1 HEPA过滤器（HEPA Filter）

       Thermo Scientific Forma CO2培养箱采用内置的高效空气过滤系统(High Efficiency Particulate Air Filter, HEPA)，配合先进的风路设计和微处理系统，持续高效捕获箱体内部循环气流中常见生物污染物和悬浮颗粒污染源，对0.3μm以上颗粒物的过滤效率达到99.97%，确保培养箱在箱门关闭后5分钟内腔体内空气质量达到Class 100级，还将大大降低培养箱内部清洗消毒工作频次。培养箱通过美国FDA批准，可应用于体外受精(In Vitro Fertilization, IVF)实验领域。HEPA 过滤器适用于所有Forma 311气套式培养箱、Forma 371GPCN 、Forma 371 Steri-Cycle 高温灭菌CO2 培养箱和Forma II 3111水套式CO2 培养箱。

       更换维护时间间隔管理：1）正常洁净环境下，每6个月至1年更换一次HEPA过滤器；2）若HEPA滤器的颜色发生变化则需及时更换；3）当培养箱内部进行彻底清洗时，也应同步更换过滤器。

       注意：用户自行操作 HEPA时，手部只触碰HEPA滤器的外部壳体，不要接触和污染内部的滤网介质部分。

3.2 CO2进气过滤器（Sample Air Filter）

       CO2气体滤器安装于箱体内部天花板的进气口与气体鼓风机之间。用于过滤来自气瓶的CO2气体中的尘埃颗粒，确保进气纯净。

       建议：每六个月到一年更换一次气体入口滤网。

3.3 接入端口过滤器（Access Port Filter OR Gas Inlet Filter）

       当CO2接入CO2/O2/N2气体后，培养箱内部空间气压上升。压力通过腔内后壁左上角的压力补偿孔释放到细胞培养间空气中。移除覆盖在开孔上的密封胶带，将新的带过滤器的橡胶塞组件安装到开孔处。

参考资料

[1] Model 310 Series Forma Direct Heat CO2 Incubator Operating and Maintenance Manual (Rev. 20)

[2] 中华人民共和国国家标准GB_T26369-2020 季铵盐类消毒剂卫生要求

[3] GB/T 42398-2023 细胞培养洁净室设计技术规范.

[4] Mary Kay Bates. Best Practices for CO2 Incubator Maintenance.