操作规程
关于抑郁症人脑类器官建模方法的讨论
关于重度抑郁症(Major depressive disorder，MDD)病理机制，已有的神经环路功能受损说（杏仁核-内侧前额叶皮质内隐情绪调节环路、腹侧纹状体/伏隔核-内侧前额叶皮质奖赏神经环路)、神经递质说、下丘脑–垂体–肾上腺轴应激反应功能调节受损说，肠-脑轴微生物菌群代谢说等广泛流行，众说纷纭。
理论来源于实践，但一切理论须在实践中来检验和才能发展。
氟西汀（Fluoxetine）、西酞普兰（Citalopram）等选择性5-HT再摄取抑制剂（Selective Serotonin Reuptake Inhibitors，SSRIs)，可选择性阻断突触前膜对5-HT的再摄取，通过间接提升突触间隙5-HT浓度而维持神经元的兴奋性，具有抗抑郁作用。由此产生了MDD单胺能递质假说。但后来的临床实践显示，SSRIs治疗起效慢，无法快速缓解抑郁症状及自杀风险，大多数接受SSRIs治疗的患者未能实现症状和功能的完全恢复，并伴有难以预期的病情波动。另外，约有1/3的患者对治疗无效或抵抗，这类抑郁症被称为难治性抑郁症（treatment-resistant depression，TRD） [1] 。而TRD患者复发率、致残率和自杀率显著高于普通MDD患者。这说明，单胺递质假说并没有触MDD发病机理和治疗的本质。
氯胺酮（Ketamine）从1966年开始作为手术麻醉剂和镇痛药在临床使用 [2] ，被发现具有极佳抗抑郁效果，成为最成功抗抑郁药之一。它由一对同分异构体R-氯胺酮 (arketamine)和S-氯胺酮 (esketamine)等量混合组成的外消旋混合物(racemic mixture)。而新上市的鼻喷雾剂艾司氯胺酮（Spravato）的药效成份为其中的S-氯胺酮。这两种药的疗效相当，可在2-3个小时内缓解减轻TRD患者症状和自杀倾向。
氯胺酮类制剂的抗抑郁作用引起了科学界的极大关注。谷氨酸（Glutamate，Glu）是哺乳动物脑内最丰富兴奋性神经递质，以大脑皮层和海马含量最高，其神经突触占脑内总突触数量的60%-80%。一般认为，氯胺酮通过阻断离子型谷氨酸受体（ionotropic glutamate receptor，iGluR）中的NMDA受体N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体，造成细胞膜对Ca2+、K+、Mg2+等阳离子通透性的改变，经一系列信号转导通路介导了抗抑郁活性。在谷氨酸能神经系统-NMDA受体理论指导下，近年来，我国学者在此领域的多项研究取得突破性进展。一是用遗传学方法确定了艾司氯胺酮靶向N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)受体的GluN2A 亚基是抗抑郁作用的直接靶点，并不参与药物致幻副作用的介导过程 [3] 。二是解析了快速抗抑郁效应链条上与S-氯胺酮结合的离子型NMDA受体三维结构，确定了S-氯胺酮在NMDA受体上的结合位点。发现表明 GluN2A亚型中的 Asn614 位点与R-氯胺酮的亲和力高于S-氯胺酮。因此，验证了R-氯胺酮比S-氯胺酮具有更持久、更安全抗抑郁作用的推测 [4] 。 该项目研究结论对氯胺酮衍生物和代谢物设计靶向人类 NMDA 受体的新型抗抑郁药具有重要引领意义 [5] 。三是，验证了在传统皮质-边缘系统情绪调节神经环路外一个全新效用脑区——外侧僵核（lateral habenula, LHb)在抑郁症发病和治疗中的关键角色，以及低血药浓度下超长疗效持续时间的全新机制 [6] 。此外，在谷氨酸神经元、Ca2+通道之外，发现主要定位于大脑胶质细胞Kir4.1钾通道参与LHb脑区神经环路对抑郁样行为的调控 [7] 。星形胶质细胞Kir4.1介导的“K+空间缓冲”功能，可清除胞外因神经活动累积的K+，从而维持大脑钾离子稳态并间接调控神经元兴奋性，揭示钾通道Kir4.1作为快速抗抑郁药物新靶点的有效性 [8] 。
氯胺酮，即毒品“K粉”，有致幻、分离样精神类症状等副作用和致瘾性。只能在医务人员监督给药，并在用药后需至少接受两个小时的健康监测，且治疗期间的大量哺乳期妇女无法给婴儿哺乳。这类药物安全性和使用便利性，群众显然不满意。
在目前对于MDD生物学基础仍不明确的条件下，抗抑郁效应所伴发的精神类毒副作用，更显出谷氨酸能神经系统-NMDA受体理论的不完善。科学界还需要对MDD病机及治疗原理做更全面、更深入的理解。
一、抑郁症GABA能中间神经元调控理论基础
大脑是由各类神经元、神经胶质细胞组成的超级复杂神经网络。大脑皮层的学习记忆及思维决策等高级认知功能，主要依赖于神经胶质细胞、兴奋性谷氨酸神经元（glutamatergic）和抑制性γ-氨基丁酸（GABA)能中间神经元（GABAergic interneuron，GINs）间的协调作用及神经网络中兴奋性与抑制性的平衡。GINs大多为局部投射神经元，拥有密集的轴突分支，可以靶向其他神经元的树突、胞体和轴突，这使它可以能够调节整个神经网络。GINs可通过摄取谷氨酸合成并释放GABA，在调节神经元兴奋性及同步震荡中发挥关键作用。大脑皮层神经回路中的生长抑素神经元(somatostatin，SST)和小清蛋白神经元(parvalbumin，Pvalb)相关GINs的异常，可以引起兴奋性与抑制性失衡。
来自MDD患者遗体脑切片的免疫组织化学证据表明，包括大脑中GABA浓度降低，GABA-A型受体及催化谷氨酸转化为GABA的关键酶——谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD)（GAD67)蛋白表达减少。在MDD患者背外侧前额叶中，发现SST mRNA 表达下降。海马、杏仁核、扣带回等都发现了SST mRNA 表达降低和SST神经元抑制功能降低。前额叶皮层(PFC)中GABA 合成酶GAD67mRNA 和蛋白水平减少，dlPFC中SST mRNA 表达显著降低。
临床研究报告，MDD患者经药物、电休克治、经颅磁刺激治疗或认知行为疗法后，大脑内GABA 含量升高，抑郁症状减轻 [9-10] 。
通过化学遗传学方法抑制小鼠前额叶皮层(medial prefrontal cortices, mPFC)的Gad1、Sst或Pvalb中间神经元，能产生剂量和时间依赖性的抗抑郁行为反应，并增加锥体神经元的兴奋性突触后电流及c-Fos和VGLUT1的表达，表明GABA中间神经元应激诱导的病理生理过程与抑郁症相关。而通过化学遗传学方法激活Gad1、SST或Pvalb中间神经元，则完全消除东莨菪碱的抗抑郁效果，并阻止了c-Fos+和VGLUT1的诱导。说明东莨菪碱通过对GABA能中间神经元的抑制而导致突触间谷氨酸爆发后，刺激谷氨酸神经元活动并促进mPFC神经元突触可塑性 [11] 。
多维度的研究表明，前额叶皮层中GABA 能网络结构和功能完整性破坏，构成MDD的病理生理学基础。
二、GABA能中间神经元相关抑郁症脑皮质类器官构建基本原理
大脑皮质中的GINs占皮层神经元数量20%，分布广泛，其形态、基因表达、环路连接以及神经电生理活动模式等具有多样性。正是GINs的异质性使得人类大脑具有复杂精细的神经调控网络和高级认知情感功能。探究GINs的起源及其多样性的发育机制，是神经科学领域目前亟待解决的核心科学问题之一。
GINs起源于位于妊娠中期胚胎发育的腹侧端脑(ventral forebrain or subpallium) 【注：胚胎端脑起源于胚胎前脑泡，随后进一步发育成熟才形成由左右半球、半球联合部级内间腔，有完成解剖结构的端脑)的神经节隆起（ganglionic eminence, GE。属于胚胎发育早起大脑的过渡性结构，随着大脑发育成熟而自然消失】。
在GE中确定特定功能后，GINs会在人类胎儿发育的几个月内先作远距离切向迁移到皮质层，继而通过径向迁移(radial migration)方式散布于整个大脑皮层，经历活动依赖的成熟过程，最终整合到皮层神经回路中。这一过程中的遗传或环境因素扰动，可能导致皮层兴奋性和抑制性失衡，被认为与包括癫痫、自闭症谱系障碍（ASD)等神经精神障碍有关 [12] 。GE根据解剖位置的不同分为内侧神经节隆起(MGE)、外侧神经节隆起(Lateral ganglionic eminences, LGE)和尾神经节隆起(CGE)。GE中的神经祖细胞也包括放射状胶质细胞（RGCs)及中间神经元祖细胞（IPCs)。祖细胞经分裂后的演变成为神经元根据基因表达差异可以进一步区分为MGE，LGE及CGE细胞群。人脑中的MGE细胞主要分化为皮层及海马中的GINs及皮层下脑区的GABA能GINs及胆碱能神经元以及部分特异性表达CRABP1及NKX2-1的神经元。MGE中间神经元的多样性在它们在仍处于祖细胞时就已经定义。而GINs多样性的提前定义对于指导GINs准确沿着迁移路径完成迁移，进而精准地参与神经环路建立极为重要。这个过程对于大脑皮层发育十分关键。与啮齿类比较，人脑中的GINs不仅数量更庞大，而且类型更丰富。MGE起源的CRABP1+NKX2-1+以及CGE起源的SCGN+CALB2+两种在人脑中特异性存在的中间神经元前体细胞，不仅在发育过程中存在也存在于成年人的大脑皮层中 [12] 。
由于人脑皮质回路中的GINs关键发育过程主要发生在人类胚胎早、中期，人类胚胎实验材料的获取大多数情况下都难以企及 [13] 。显然，构建类似于人类大脑前额叶皮层GABA 能神经网络的结构和功能的类器官模型，只能遵循胚胎时期人脑皮质本来的发生、发育路径，采用人类多能干细胞来源含GINs腹侧前脑类器官与含有谷氨酸能神经元的前脑皮质共培养，便于GINs分化完成后按自然规律从皮质下层向大脑前额叶皮层的定向迁移，在皮层整合和进一步发育。可喜的是，相关脑区特异性神经球体及组装、整合探索工作已由斯坦福大学医学中心的研究团队于2017年宣布成功完成（可算是有可摸着过河的石头了)。
三、 MIAOU标准视角下抑郁症人脑类器官表征内容
基于学界对脑类器官的定义 [14-16] ，抑郁症脑类器官应是由hPSC 衍生的祖细胞、神经元和神经胶质细胞在体外自组装而成，并在一定程度上具备抑郁症患者体内发现的神经组织发育特征的三维结构细胞模型。
好的类器官的定义标准是更忠实地概括人脑特征。艾伦脑科学研究所率先建立的综合人脑图谱，包含免疫组织学immunohistology、原位杂交in situ hybridization和转录组学数据transcriptomics，为类器官工程师提供宝贵的参考资源 [17] 。鉴于GINs特殊的起源、迁移和发育规律，大脑皮质类器官理应是腹侧端脑和大脑皮质两个区域特异性脑类器官有机组装衍生的类器官组装体。
欧盟《关于类器官及用途的最低限度信息标准》（MIAOU标准)中，将类器官表征列为类器官实验标准化体系的元数据(metadata)内容加以规范，以提高不同组织类器官来源、样品批次研究间的可重复性(reproducibility)、可复制性(replicability)，促进类器官生产稳健性的同时，方便研究人员自信地与其他科学家分享研究经验。MIAOU所列的类器官表征工作的内容，包括结构组学（基因组学、转录组学、蛋白质翻译后修饰、细胞代谢、器官特有的生物标志物等)、形态学以及视类器官用途而定的具体功能测读等 [18] 。
大量研究已证实，与健康人iPSCs来源的神经元比，MDD患者iPSCs来源的各种类型的神经元、神经胶质细胞,都出现神经元线粒体功能受损、电生理特性以及包括 CACNA1C（钙信号传导有关）、SLC6A4（与5-HT的转运有关）和BDNF（突触可塑性有关）等差异表达基因(DEGs)和神经元的HTR2A、HTR7受体表达变化 [19] 。因此，对以GINs发育调控功能研究为目的腹侧脑类器官模型,和以研究抑郁症的病理学和治疗学研究目的腹侧脑类器官模型的表征，由于应用场景不同，所用标准方法和要素应该是有所区别的。后一种情况下，所构建的模型理应在抑郁症有关的细胞功能、分子特征上有所体现。
“Depressive patient-derived GABA interneurons reveal abnormal neural activity associated with HTR2C” 一文（为方便表述，以下简称“ventral forebrain organoids一文”） [10] 与MIAOU标准中有关内容（见：GABA能中间神经元相关抑郁症脑皮质类器官生成和表征方法解析）的对照结果见表1。
表1 所引范文与MIAOU标准对类器官表征元数据的对比
MIAOU标准内容 | 范文披露内容 |
形态学/结构 | |
描述外观、大小、形状等。 | 单个GIN形态Sholl分析 |
评估不透明度/折射率。 | / |
量化器官内和器官间的同质性 | GABA和TUJ1阳性细胞计数 |
形态学、结构和超微结构特征以及组织细胞类型 | 单个GIN形态Sholl分析 |
分子表征 | |
提供基因组、转录组、代谢组和蛋白质组学信息 | 5-HT2CR蛋白质表达水平Western分析； 5-HT2CR mRNA实时PCR分析； 转录组分析(Bulk RNA-seq) 单细胞RNA测序（scRNA-seq) |
指出预期的特异性分子标记物、表观遗传特征 | 免疫细胞化学（Immunocytochemistry) 细胞标志物荧光图像定量分析： 神经祖细胞标志物 SOX2； 腹侧前脑祖细胞标志物 NKX2.1； GABA 能神经元标志物GAD67； |
功能表征 | |
定性和定量的功能特征 | 单细胞钙活性共聚焦成像定量分析（Calcium imaging) GIN神经元活性全细胞膜片钳记录分析 |
说明处理方案（药物、化学、物理、激素等) | 钙成像：Fluo-4 AM 加载溶液 电生理测定：Trzd 处理 |
可追溯性和类器官漂移 | |
描述组分的可追溯性 （批次、供应商等、环境、补充物) | iPSC维持：Essential 8培养基培养 iPSC分化：神经诱导培养基（NIM: 500ml F12 + 5ml N2 + 5ml NEAA) iPSC细胞解离试剂：Stemcell，1 ml/孔 类器官培养：Matrigel |
给出条件培养基可追溯标准 | / |
类器官的定性漂移标准 （形态学、结构、功能、分子等) | / |
评估稳健性（相同的起始细胞，相同的类器官)？ | 人外周血单核细胞(PBMC) CytoTune-iPS 2.0试剂盒PBMCs重编程 腹侧前脑类器官 |
整体上，ventral forebrain organoids一文中对GIN神经元生成的腹侧前脑类器官表征要素，基本符合欧盟MIAOU标准表征技术要求。但在于对该类器官细胞抑郁症表型的表征元数据有所欠缺。
GAT1与GABBR2、GAD65与GAD67通常被视为GABA能神经元标志物。GAD67作为是人脑中早期大脑GINs发育的特异性GAD亚型。而GABA转运蛋白1（GAT1)和GABA受体2（GABBR2)则是在GIN细胞膜上的表达两种GABA转运受体。GABA转运体主要负责突触释放的GABA的重摄取，控制细胞外GABA的浓度，而调节下游神经元的电兴奋性。实验中关注了神经元发育中的GAD67的表达，但对于GAT1与GABBR2，无论是基因转录层面、蛋白表达层面均未提及。此外，对于大量报告观察到的MDD患者iPSC来源神经元生物能量和线粒体代谢异常问题，文中亦未涉及。
四、 GABA能中间神经元相关抑郁症脑皮质类器官方法问题
2017年，斯坦福大学医学院精神病学与行为科学系Fikri Birey等人的“Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids”在Nature发表。文中介绍在已经建立的大脑皮层（pallium, hCS)区域特异性3D 神经培养物（包含深层和浅层皮质谷氨酸能神经元以及星形胶质细胞)基础上，构建了皮层下(subpallium, hSS)脑区神经球体，经hSS-hCS共培养生成了同时包含皮质谷氨酸能神经元、星形胶质细胞及GINs的前脑球体的组装球体（assembly of forebrain spheroids)，即组装前脑类器官 [13] 。
ventral forebrain organoids一文强调其类器官实验方案是基于Yuan等2020年发表研究报告中的方法 [20] 改进而来，同时提及Birey等人的上述文章。
表2 两篇报告中类器官生成过程元数据信息的对比
文献来源 | Nature. 2017 | Protein Cell. 2020 |
hCS的生成 | 用0.35mg/ml的分散酶将完整的hiPSC细胞团从培养板上挑出，并转移到含有两种SMAD抑制剂——dorsomorphin（DM；5μM；Sigma)和SB-431542（SB；10μM，Tocris)，及ROCK抑制剂Y-27632（10μM；EMD Chemicals)的hPSC培养基中的超低吸附塑料培养皿中。 在最初5天里，每日更换一次hPSC培养基，并添加DM和SB-431542。 第六天，悬浮培养的神经球被转移到含有Neurobasal-A（Life Technologies，10888)、无维生素A的B-27补充剂（Life Technologies，12587)、GlutaMax（Life Technologies，1：100)、青霉素和链霉素（Life Technologies，1：100)的神经培养基（NM)中，并添加生长因子EGF（20ng/ml；R&DSystems)和FGF2（20ng/ml；R&D Systems)，直至第24天。 从第25-42天，培养基中补充生长因子BDNF（20ng/ml；Peprotech)和NT3（20ng/ml；Peprotech)，每两天更换一次培养基。 从第43天开始，类器官在无补充物培养基中维持，每4-6天更换一次培养基。 | 背侧脑类器官的生成： 胚胎体(EBs)在神经诱导培养基(NIM)中连续培养至第35天或更长时间（在自发条件下培养，不经慢病毒转染)。 |
hSS的生成 | 在培养的前23天，培养基中添加了额外的小分子 从第4天到第24天添加Wnt信号通路抑制剂IWP-2（5μM；Selleckchem)。 从第12天到第24天添加SHH信号通路激动剂SAG（100nM；Selleckchem)。 从第25-42天，培养基中补充生长因子BDNF（20ng/ml；Peprotech)和NT3（20ng/ml；Peprotech)，每2天更换一次培养基。 从第43天开始，在无补充物培养基中维持，每4-6天更换一次培养基。 | 腹侧MGE类器官的生成： 胚胎体(EBs)在神经诱导培养基(NIM)中连续培养,从第10天开始到第25天，每日加入500nM SAG。 |
病毒标记 | 将hCS或hSS转移至含有300μL NM病毒的1.5ml微量离心Eppendorf管中，并孵育过夜。 第二天，将神经球体转移到超低附着板中的新鲜NM培养基中。 慢病毒用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher)转染HEK293T细胞在72小时后用Lenti-X浓缩器浓缩上清液生成。 腺病毒（AAV-DJ1-hSYN： mCherry)在斯坦福大学斯生成。 | 第25天用搭载GFP的慢病毒载体转染腹侧MGE类器官。 将类器官转移到培养基培养皿中，向每个类器官中加入50μL NIM培养基以防止干燥。 类器官置于Nikon SMZ800N显微镜下，调整物镜到适当放大倍率，用微量注射器注射，每种类器官各注射两次，每次0.5μL病毒液。注射完成后加入50μL病毒稀释溶液。 孵育24小时后，类器官移至补充有3mL NIM培养基的T12.5细胞培养瓶中。 |
组装前脑球状体 | 将 8-10天前病毒标记的hCS和hSS（~60- 90天的体外分化)转入1.5ml离心管中3天，并置于CO2培养箱中培养。 在此期间，超过95%的hCS和hSS 融合。 用P-1000移液器将hSS-hCS培养物小心地转移到Corning 24孔超低吸附板中，每2-3天非常温和地更换培养基。 | 分别将一个背侧脑类器官和一个腹侧MGE类器官放在一个1.5ml的EP管中，在37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养，三天后生成融合型类器官。 |
对比两篇报告中类器官组装体的制备方法，从PSCs分化、生成区域性脑类器官到最后生成前脑类器官组装体，主要步骤、关键控制时间节点基本一致，主要区别在于细胞诱导分化过程中培养基添加物的不同和实验总时间差异。据此，认定两个报告分别采用了两种不同的方法生成了具有功能、胚胎学部位一致的前脑皮质类器官组装体似无争议。
但从两篇报告中实验流程细节信息看，Birey等提供的方案显然更有参考价值。
ventral forebrain organoids一文，明确指出全套HPSC衍生类器官组装体的培养操作源自用该实验室2020年开发成功的实验方法生成的。但这套自创实验流程方法与而Birey等人报告的实验协议和MIAOU技术标准对比可知，实验细节描述不仅仅是过于简略问题，而是有诸多流程的元数据信息缺失，显然与欧盟MIAOU对类器官实验信息披露要求不符。
譬如,脑区类器官生成所用的HiPSCs克隆的筛选方法、传代数控制、人体材料的遗传背景控制、培养过程支原体检测结果、E8培养基补充物的信息、传代接种密度；从拟配体生成类器官过程中，培养基及所用补充物、是否使用了基质、接种条件和培养基更换频率、基质单位体积的接种密度、培养基中每单位面积的基质液滴体积、培养基用量、类器官扩增时的解离方法。两种类器官优于分化、扩增时序和时程不同，中间是否进行过超低温保存和复苏，冻存和复苏条件。
此外，在类器官转录组测序和单细胞测序环节，对类器官培养物的解离方法、单细胞悬液制备方法等，都缺少比较的描述信息。
类器官病毒感染操作的技术细节和质量控制，信息也不够详实。
类器官实验操作规范化、标准化，是目前学界共同关注和亟待解决的技术问题，理应值得所有实验则重视。所谓言之无文，行而不远。当研究工作中使用自主开发的技术方法时，更应慎之又慎。这既确保不同实验室之间的类器官培养结果具有可比性，又可以研究人员进行准确而自信的技术交流，对推动自主技术从实验室研究走向产业化发展有重要意义。而该文所提供的信息如此简略含糊，匪夷所思。较合理猜测是：这一套类器官实验流程还没有真正固定成型，所生成的类器官模型稳健性还有待完善。
五、关于抑郁症人脑类器官建模的设计思路
《素问•脉要精微论》提出“头者，精明之府”，这相当于美国神经科学家Paul D. MacLean 1960年提出的三脑理论（Triune Brain Theory）——人类大脑具有本能脑、情绪脑和理智脑的三重功能，三者间既功能独立又互联互通。
与“三脑”相应的结构是脑干系统、边缘系统和大脑皮层系统。实际上，人脑有数十个功能各异的脑区，脑区之间或相互激励，或相互抑制，所组成的信号网络结构之复杂，得借助于现代人工神经网络才能概括。但这样一副神经网络图，还远不足以清楚阐释抑郁症等精神疾病的病理生理过程，目前还缺少如LHb、RMTg、DRN、NAc、VP等大量功能节点元件和神经纤维联系。
抑郁症人脑类器官模型的核心价值，在于具备MDD患者特异性遗传背景，最大程度模拟特定脑区、脑神经环路的组织结构和生理功能特征。因此，构建抑郁症脑类器官，一要明确所模拟的功能脑区，二要关注神经递质受体通路。
资料显示，内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortices, mPFC)、海马（hippocampus）是MDD患者临床检验及动物实验中报道最多的脑区。而伏隔核（nucleus accumbens，NAc）、腹侧苍白球（ventral pallidum，VP）、中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）、外侧下丘脑（lateral hypothalamus，LH）和中缝背核（dorsal raphe nucleus, DRN）等大脑边缘系统组件，则是奖励反馈 [21] 、疼痛 [22] 、药物成瘾 [23] 、睡眠和觉醒[ 24]等生理过程的神经生物学机制研究重点关注的脑区。多个研究项目通过神经通路示踪技术和电生理学方法记录关联脑区间神经纤维投射，以阐述脑区间内在调控逻辑。外侧缰核（LHb）为连接前脑边缘系统（limbic system）和中脑单胺核团的枢纽，是大脑“反奖励中枢”，与中脑“奖励中心”的单胺核团相互拮抗，抑制边缘系统的奖赏效应导致抑郁发生 [6] 。无论是对药物作用机制的解释，还是大脑特定脑区、神经回路功能的研究，应跳出单一脑区内、神经元的视野，将所观察到的靶点受体、信号转导通路、神经递质传递、电生理特征和神经元突触可塑性（synaptic plasticity）等局部现象，还原到人脑神经网络环境中，判断局部节点内的变化区域特异性变化还是全局性改变，同时判断这种变化对神经回路中其它功能节点的影响。
中枢神经系统5-HT受体有多种亚型，包括5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4、5-HT5、5-HT6及5-HT7，除5-HT3属配体门控离子通道外，其余均为G蛋白偶联受体。NMDA受体在调节神经元的树突、轴突结构发育，参与突触可塑性和神经元回路的形成起着关键作用。NMDA受体是由NR1、NR2B、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A和NR3B等不同亚基构成的异四聚体（heterotetramers）。功能性NMDA受体至少含有一个NR1亚基和一个NR2亚基。由NR1与NR2组成的复合物体中，两个NR1和NR2也可能是异质的。此外，NR1、NR2和NR3还可组装成NR1/NR2/NR3的聚合体。不同脑区NMDA受体亚基组成并不一样，离子通道的选择性存在明显差异，介导的电流形式不同 [25] 。在哺乳动物脑组织内，NR2A、NR2B、NR2C和NR2D亚基的NMDR受体分布与脑皮质、海马、前脑、间脑和脑干等不同脑区。NMDA受体多样性和空间分布异质性，定义不同脑区调控功能多样性。
GABA通过离子型GABAA受体和代谢型GABAB受体介导神经元的抑制。GABAA受体属配体门控离子通道受体，具有存在苯二氮卓类和巴比妥的结合位点，受体激活后氯离子通道开放，氯离子内流使突触后膜超极化，引起快抑制性突触后电位，发挥镇静与抗焦虑功能。GABAB受体属G蛋白偶联受体家族，分布于中脑和脊髓。在GABA能和谷氨酸能神经元突触前膜表达，可通过抑制Ca2+通道抑制囊泡融合和神经递质释放。而突触后激活可导致G蛋白门控内向整流钾（G-protein-gated inwardly rectifying potassium,GIRK)通道介导的神经元超极化，控制神经元的兴奋性。
大脑内部功能分区的多样性，神经递质受体组成类型空间分布的特异性，对脑类器官的脑区选择、功能的表征和实验结果的解读，应基于脑区和区域特异性受体进行。而忽视大脑神经网络的作用，脱离具体靶位讨论药物作用机制和药效靶点，难免以偏概全之嫌，甚至引出不恰当的结论。
在目前MDD病理机制尚不清晰条件下，在偌大的神经网络中，选择哪个功能节点作为MDD脑类器官模拟靶标，尚无足够可参考经验。
按先易后难、先简单后复杂的指导思想，避开mPFC等大脑皮层高级神经中枢而选择神经纤维组成、神经纤维投射相对简单的皮质下中枢，将极大降低类器官构建和后续实验结果解析的技术难度。而基于实践与理论辩证观，从已验证的快速抗抑郁效用部位、效用靶点和神经环路机制出发设计类器官，是可靠稳妥、事半功倍的选项。
譬如，艾司氯胺酮通过阻断GluN2A NMDA受体通道，抑制小鼠、人体间脑LHB的簇式放电，而解除其对“奖励中心”的抑制 [6] ，逆转抑郁表现。选择LHb作为脑类器官的核心靶标，构建LHB脑区脑类器官,可用于GABA受体、NMDR受体、5-HT受体靶点药物、不同治疗方法对神经元形态与功能改变进行观察。在此基础上再构建包含LHB的神经环路的类器官组装体，如LHb - DRN、LHb - VP、LHb-RMTg、LHb-VTA、LHb-NAc、LHb-Hippo，特别适合在脑神经网络的大背景下，研究“反奖励中心-奖励中心”的神经网络调控机制和网络节点联动反应，将助于系统而清晰的阐述抑郁症病理生理基础、抗抑郁治疗机制及抗抑郁治疗毒副作用发生原理。
六、关于神经药理学家眼中的“完美”抗抑郁药物问题
目前，科学界还缺少人脑神经递质受体分布图谱和人脑神经网络图谱可靠。基于个别脑区获得的实验数据，并不能代表整个大脑神经网络的整体性反应。由于正常成人、DD患者与实验动物基因组表达调控的差别，神经网络个节点功能区神经递质受体、转运体分布的异质性，对某一局部观察到的实验现象，切换到神经网络另一节点后，极有可能是弱化、阴性甚至相反变化。正如人类大脑内部不停地前进与后退、情绪失控和保持理智之间作出选择那样，氯胺酮在抑制LBb神经元兴奋性的同时，在网络中另一个或多个节点同时发出其它反应。而药效与精神副作用正是人脑神经网络对氯胺酮局部给药作出一种客观综合反应的输出结果。
如同硬币的正反双面，凡事有利必有弊。正如“按下葫芦浮起瓢”的道理，单一成份药物作用于大脑复杂神经网络后的整体反应输出，还存在太多未知。收获疗效而消除全部副作用，从哲理上讲，恐怕不易实现。
联想到人类抗艾滋病的鸡尾酒疗法，采用多种组分组合或采用复杂化学组分的中药及中药复方，从多个节点、多个靶标和神经环路同时发力，可能更有利于创造出完美的抗抑郁效果。
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