混沌若教休凿窍-细胞冻存管外形尺寸差异在不同应用模式下对温控性能的影响-中篇

(前续：细胞冻存管外形尺寸差异在不同应用模式下对温控性能的影响-上篇)

二、冻存管外形尺寸对不同应用模式下样品温控性能影响的分析

       冻存管是通过管壁与外界环境充分接触完成升温降温的。除恒温水浴、液氮型程控降温仪两种应用环境可以忽略冻存管管底外形、管盖和管身直径外，包括细胞程序降温盒、免液氮型细胞程序降温仪在内，为达到设计的升降温速率指标要求，对所用的冻存管容量、规格尺寸理应存在一定要求。

2.1 细胞梯度降温盒的运用

       Nalgene Mr. Frosty细胞梯度降温盒（Mr. Frosty Freezing Container）、CoolCell LX细胞梯度降温盒（Controlled-rate cell freezing container），在干细胞和类器官实验研究报告中，被用于将添加DMSO类冷冻保护剂的细胞预冷至-80℃后（即常规缓慢冷却处理）再转入液氮气相环境完成样品玻璃化转变和长期保存（可参考：组织细胞玻璃化保存技术的应用原理及实施方法）。

       Mr. Frosty以异丙醇（Isopropyl Alcohol，IPA）为冷媒，在-80℃环境下使样品以约-1℃/分钟速率均匀缓慢地预冷至-80℃。CoolCell LX细胞梯度降温盒由美国Biocison公司原创，与 -80℃冰箱结合提供-1℃/分钟冷冻速率。CoolCell LX由均匀密度的交联聚乙烯泡沫（cross-linked polyethylene foam）外壳和内置金属导热模块组成。CoolCell中交联聚乙烯泡沫的作用相当于Mr. Frosty中的IPA，它既是冻存管与外部-80℃超低温环境隔离的物理屏障，同时因其比热容极低，可实现冻存管与外部低温环境间缓慢地的热交换，避免冻存管温度断崖式迅速降低而损伤细胞，适用于大多数细胞和细胞系预冷处理。

       高效且均匀热交换过程，依赖于冻存管与容器壁充分接触。Mr. Frost工作时，冻存管插入样品管架内，管并不接触IPA而是通过管架孔壁间接与IPA进行热交换。CoolCell LX则是通过样品管壁与交联聚乙烯泡沫直接进行冷热传递。冻存管管身外径与容器样品孔孔径不匹配，极有可能出现只有管壁一部与孔壁相切而其余部分与孔壁分离现象，造成管内冷却不均。因此，二者对适用的冻存管尺寸规格有限制性要求（见表4）。

表4. 细胞梯度降温盒的冻存管兼容性

       如图7所示，管身部分与管架孔壁贴合不够严密。冻存管载入Mr. Frosty后，管盖部分突出于样品孔外、为容器内空气所包围。因此，管冷却过程，是IPA-管架-冻存管壁、盒上部的空气-冻存管盖两种作用综合的结果。                                              

       Coolcell LX的前身为Coolcell，其样品孔较深，管整体埋没于样品孔内。这不仅不便于冷冻完成后管的转移，还使管盖直径大于管身的外旋盖冻存管的管身与容器孔壁出现间隙，降低热交换效率。因此，迭代设计的Coolcell LX，冻存管管盖外露于样本孔外，管身与孔壁接触充分。安装盒盖后，整个管身，即管盖、管身和管底，被Coolcell LX盒完全包裹。相对于Mr. Frosty，Coolcell LX盒与冻存管接触面更大。故管径与样品孔孔径匹配，管身、管盖直径一致的平底冻存管、圆底管，与盒接触更有效，具有天然的热交换效率优势。

       通常，细胞溶液温度在从常温逐步冷却至玻璃化转变温度过程中，会发生体系内潜热的释放。潜热释放造成体系温度升高，热动力学过程的潜热峰在温度曲线上表现是曲线突然上升，或下降的曲线突然变得平缓，直至潜热释放过程结束后，温度曲线斜率逐步恢复。不同溶液组分、浓度与不同细胞样品，潜热峰出现的时间、温度不同，故不同样品降温曲线的平滑度和线性特征存在差别。

       对比Mr. Frosty、Coolcell LX的测试温度曲线发现，Mr. Frosty的曲线在从0～-60℃过程中，因样品体系潜热释放干扰，温度动力学曲线折点多，而Coolcell LX的温度曲线整体平滑，多个样品间温度曲线走势完美重合。两种装置中样品温度动力学曲线的差异化，根本原因在于冻存管与容器有效接触面积不同，热交换效能不同，从而应对体系内部潜热释放、平抑温度曲线波动的能力有显著差别。

       因此，不同的冻存管外形款式、规格尺寸，运用于Mr. Frosty、Coolcell LX两款细胞冷却装置时，冷却效能差异是客观存在的。这种差异导致标称容量相同冻存管的实际温度动力学表现不同，影响的是样品处理的均一性、可重复性。

       冻存管外形、尺寸与冷却容器的兼容性对实验结果的影响，比标称容量因素更有决定意义。

2.2 免液氮型程序降温仪运用

       Bio-Rad PCR管、8联排管和96孔PCR板有High-Profile、Low-Profile之分。CFX Duet、CFX Opus 96用Low-Profile款样品管时，PCR模块热盖与管盖接触紧密减少管盖冷凝液生成，同时热盖向下压力均匀分配至每个反应管上，使管身与反应模块贴合，实现最佳热传递和所有反应孔一致的变温曲线。

       Grant CRFT、Cytiva VIA、Strex-CytoSAVER等面液氮型程控降温仪（Freeze liquid nitrogen-free controlled‑rate freezers），是采用高效液氦制冷控温系统，通过导热性能优良的铝制模块控制冻存管温度快速变化，用于冷却哺乳动物组织器官、干细胞、生殖细胞等实验材料。仪器具有多种平底样本模块，分别用于0.5mL、1.0mL、2.0mL冻存管、0.5mL CBS标准冻精麦管（straws）、SBS标准平底微孔板（PCR板、细胞培养板等）封装样品，控温精度±0.5℃、温度均匀性±1.0℃，可以最高速率10℃/min将样品冷却至-80℃ ～-100℃。

       而T/ZZB 1653-2020标准（见表1）显示，不同容量冻存管，除管身高度不一，管壁厚度(0.7-1.3mm)也有差异。当冻存容器的外形、尺寸规格与样本模块样品孔严格匹配，实现管壁与孔壁严丝合缝，方可获得最佳热交换效率，样品温度变化对样品模块温度改变的响应更灵敏，样品温度曲线与程序控制模块温度曲线重合程度高，可确保干细胞、类器官材料玻璃化冷冻过程获得高可靠性、高重复性结果。

2.3 冻存管盒的运用

       Nunc、海尔、安进特、绿冻、NEST、洁特等大多数品牌0.5 - 5.0mL容量冻存管的管径均处于12 – 13mm区间。而巴罗克1ml外旋盖（88-110X）、2.0ml外旋盖（88-020X）、5.0ml外旋盖（88-050X）、Nalgene 5000-0012、5000-0050冻存管管径达到13.5mm。

       管径粗细，对于习惯于将冻存管用塑料袋散装储存的用户并无大碍。塑料袋如无透气孔，则散装样品管特别是处于袋底部被深埋的样品管，冷却至最终安全储存温度的时间，比带气孔冻存管盒当然要长很多。因此，散装储存方法看似操作简便，但对于温度敏感型样品而言，弊大于利。

       如图10所示，不同制式冻存管盒对冻存管兼容能力有差别。

       eppendorf 9×9格2英寸管盒(A)，底座多孔板结构，孔径11.9mm，可用于管身直径10.8 - 11.9mm细管；

       eppendorf 10×10格2英寸管盒(B)，底座分隔立柱设计，与立柱相切管的最大直径12.65mm，可用于管身直径10.8 - 12.5mm管，覆盖0.5- 2.0mL的冻存管大部；

       eppendorf 9×9格2英寸管盒(C)，底座多孔板的孔径13.15mm，相邻孔间距1.0mm，则可容纳管径12 - 13.0mm的粗管；

       Nest 1.5mL 10×10内旋盖冻存管盒(D)，适用管径12.2mm以内细管。Nest 1.5mL 10×10冻存管盒(E)，对市面1-2.0mL管兼容性优于前者。

       可见，冻存管盒孔径12.5-12.85mm的管盒，对不同来源冻存管兼容性优于其它选项。

       0.5mL- 2.0mL容量冻存管管长度1.2 – 2.0英寸，与标准9×9孔、10×10孔2英寸冻存管盒匹配。

       3.6mL冻存管长2.8- 3.0英寸，需使用3英寸或3.5英寸冻存管盒，如Eppendorf 3 inch 9 x 9冻存管盒0030140540、3英寸 5 x 5冻存管盒。

       4 .0– 5.0mL冻存管长3.01- 3.62英寸，需用eppendorf 9×9格冻存盒(0030140567)、绿冻81格LD9X9PC-95冻存管盒类似4英寸厚管盒。

       选择第三方管盒储存时，管容量、自身的外形尺寸与冻存管盒的兼容性须引起重视。

2.4 冻存架的运用

       填充细胞样品的冻存管采用冻存管盒、冻存架储藏，可确保管身始终保持竖直挺立，液面与管盖、管口的高差可避免液样与管盖冻结。

       冻存管长度决定了冻存管盒厚度，也就确定了冻存架层高。

       0.5mL- 2.0mL容量冻存管管长1.2 – 2.0英寸，与市面各种标准2英寸层高冻存架兼容。3.6mL冻存管长2.8- 3.0英寸，配套3英寸或3.5英寸冻存架。4 – 5.0mL冻存管管长3.01- 3.62英寸则需使用4英寸层高冻存架。

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