零丁洋里叹零丁——从冷冻保护剂的化学特性看细胞延迟性死亡的应对策略-上

       根据国际生物与环境储存库学会（International Society for Biological and Environmental Repositories, ISBER）2012年颁布的《研究用生物材料收集、存储、检索和分发存储库最佳实践》指南 ^[1] ，-132℃，即水的玻璃化转变温度，是所有生物活性反应停止之临界温度 ^[2] 。

       在−132℃到−196℃的深低温环境中，生物样本材料中的动能和分子运动显著降低，新陈代谢、主动运输、酶促反应及扩散等过程均极大减弱甚至完全停滞 ^[3] ，避免细胞因长期培养导致的表型漂移（phenotypic drift），可最大程度保持冷冻前的功能状态和结构的完整性。报道显示，在液氮中保存了28年的人类精子依然保持着与卵母细胞透明带的正常结合能力 ^[4] 。人体心脏主动脉瓣在液氮中储存长达10年后，依然保持成纤维细胞表型、结构保存完好 ^[5] 。因此，低温保存方法在再生医学、辅助生殖治疗(assisted reproduction technology, ART)、生物医学基础研究、畜牧繁殖、生物多样性保护与濒危物种保育和生物种质资源保存领域的都具有关键应用价值 ^[6] 。

       近年来，人类胚胎干细胞（human embryonic cell, hES）、类器官等干细胞衍生制品在临床治疗、基础科学研究及体外药理毒性筛选中的潜在应用引起广泛关注。过去数十年来所采用的各种低温冷冻保存方法，对于悬浮培养细胞的保存较为理想，但用于干细胞、组织（如皮肤、血管和软骨）和生殖器官等组织类型的储存时，还面临回收率低、组织断裂受损等多重挑战。据报道，用传统冷冻保存方案复苏后，干细胞的损失占比可高达60-70% ^[7] 。以常规体细胞和鼠类胚胎干细胞冻存方法保存的hES细胞，存活率只有5%左右 ^[8] 。因此，有效的hES及衍生品冷冻保存方案匮乏，被认为是制约新型细胞技术研究应用的瓶颈。

       生物样本中的降温过程中，胞内冰晶形成与生长与复苏升温阶段再结晶所产生的机械损伤与溶液渗透压失衡、冷冻保护剂的细胞毒性、储存温度波动等因素，造成了细胞损伤、低恢复率。此外，传统玻璃化技术可处理组织体积与通量偏小，还无法有效满足科研临床实际应用要求。根据人体干细胞、组织类器官材料的特性，探索可最大限度降低细胞损失、维持细胞功能活性和应用要求的组织细胞保存方法，是当前温生物学领域所面临的主要挑战。近年来，组织细胞低温保存技术方法研究重新引发学界的关注，对新型细胞低温防护材料、快速冷却降温方法和超快解冻复温技术开发应用有升温趋势，在工程技术上已取得阶段性重要突破 ^[9-11]

       基于多数人对于冷冻保存相关的细胞死亡、常用细胞低温冷冻保护剂作用的理解，本文从水分子与细胞密切相互作用角度，对低温保存过程中细胞损伤的可能诱因和未来新型细胞冷冻保存试剂开发策略作了讨论。                                              

一、对冷冻保存过程中细胞死亡现象的认识过程

1.1 经典细胞死亡冰晶说

       巴西尔·卢耶特（Basile J. Luyet）是1964年在美国成立的国际低温生物学会（Society for Cryobiology）成立时的首任会长 ^[12] 。他1927年在瑞士日内瓦大学获得物理学博士学位后留校任教，1929年前往美国耶鲁大学从事生物学博士后研究。1931年始在美国圣路易斯大学担任生物学副教授，正式开启了低温生物学的研究生涯。1934年，创办学术期刊《Biodynamica》时，卢耶特身兼编辑、出版人，同时也是主要撰稿人之一 ^[13] 。自然科学和物理学研学经历、德国物理化学家塔曼（G. Tammann）的结晶动力学原理理论，使卢耶特养成用物理定律来定义生物学中物质状态的思维习惯。正是他，将物理化学与生物学结合而推动了一个新的科学分支——冷冻生物学的诞生。

       卢耶特在“The Vitrification of Organic Colloids and of Protoplasm”（有机胶体与原生质的玻璃化）一文中提出了低温生物学领域的一个基础理论：细胞内对冰核和冰晶形成的控制，是决定所有冷冻保存细胞活性的关键环节。胞内液态水转化为冰晶的聚集状态变化，是细胞死亡的首要诱因。为抑制结晶过程，吕耶特提出了“玻璃化(Vitrification)”的概念原理，目的是将液态物质转化为无晶体结构的与玻璃属性类似的非晶态固体 ^[14] 。

       1938年，卢耶特和Hodapp报告了第一个玻璃化冷冻保存精子的成功案例。1940年，卢耶特与Pierre M. Gehenio修女在“Life and death at low temperatures”（低温下的生与死）著述中对玻璃化的基本原理做了阐释：“使物质玻璃化的唯一方法是将其置于液态或气态并迅速冷却，以便在比材料冻结所需的时间更短的时间内跳过结晶温度区域”。而“为避免冻结，物体温度应以每秒数百摄氏度的速度下降” ^[15] 。晶核一旦形成，晶体的生长速度会进一步加快。若要避免结晶，物质必须快速度降温越过溶液结冰温度区。当温度到达玻璃化转变温度以下时，溶液就已转变成非晶态固体，水分子热运动被严格约束，相互间无法聚集而保持着无序分布状态。玻璃化技术思想建立的年代，甘油对低温生物组织储存的作用尚未被发现，受限于当时璃化冷冻降温技术的限制，玻璃化保存方法迟迟难以落地推广实施。

       格雷戈里•M•法伊(Gregory M. Fahy)为美国红十字会的应用冷冻生物学家。他继承了卢耶特的玻璃化思想，提出通过玻璃化冷冻技术器官保存的技术构想，并在1985年的小鼠胚胎玻璃化保存获得成功小鼠胚胎冷冻玻璃化保存技术 ^[16] 。得益于甘油和二甲基亚砜(DMSO)等细胞低温冷冻保护剂在生物组织材料保存的普遍应用经验，法伊以较低的冷却速率实现样品的玻璃化转变，将原本小体积样品适用的处理技术拓展用于大型组织和器官冷冻的保存，玻璃化冷冻保存技术理念实用化获得成功 ^[7] 。1990年代的中期后，玻璃化冷冻辅助生殖技术成功案例涌现，充分证明玻璃化保存方法的冷冻损伤风险低、细胞存活率高优势 ^[17] ，得到学界普遍关注和认可。

       彼得•马祖尔(Peter Mazur, 1928-2015)是低温生物学界的另一位泰斗，曾于1973-1974年担任美国冷冻生物学会会长。他发表的170多篇学术论文中，有4篇为科学界奉为“引用经典”（Citation Classics）论文。马祖尔创立了冷冻保存领域著名的“冷冻损伤的双因素假说”（Two-Factor Hypothesis of Freezing Injury）。

       1963年在“Kinetics of Water Loss from Cells at Subzero Temperatures and the Likelihood of Intracellular Freezing”一文中，马祖尔指出，细胞缓慢冷却降温可提高细胞存活率的思想。在“The Role of Cell Membranes In the Freezing of Yeast and Other Single Cells”中，他深入探讨了酵母及其他简单细胞的细胞膜特性如何影响冷冻过程中的细胞存活或死亡概率。1970年，通过对比不同冷却速率对细胞存活率的影响后，他指出，实现细胞最高存活率所需的冷却速率因细胞类型而异，而且与冷冻溶液中的盐浓度密切相关 ^[18] 。1972年，马祖尔与合作者在“A Two-Factor Hypothesis of Freezing Injury: Evidence from Chinese Hamster Tissue-culture Cells” ^[19]一文中正式提出了“冷冻损伤的双因素假说”的术语。在对这一术语解释过程中，旗帜鲜明地提出了细胞冷冻保存中的中等冷却速率（intermediate rates of cooling）、快速解冻复温的指导原则。由此衍生的中等速率冷冻+快速复温解冻方法，正是现在称为“缓慢冷冻保存法”原理之精髓。

       概况起来，冷冻损伤双因素假说的内涵主要有以下几点 ^[20] 。

1）冷冻过程中细胞损伤由盐浓度和冰晶两种因素共同决定

       高盐浓度损害与缓慢降温方式相关，而冰晶损害发生于快速冷却模式。细胞溶液冷却时，温度下降到溶液的冰成核温度后，胞外水会与溶解盐分离而首先结冰。随着冰晶形成，未冻结溶液中的盐浓度逐渐升高，造成了胞膜内外盐浓度的差，进而推动细胞内的水分子通过渗透作用向高盐区域迁移，以维持细胞内外渗透压平衡。细胞内外水分的流动速度取决于降温速率。快速降温能缩短细胞的高盐暴露时间，但同时也缩短了细胞内水分渗出时间，大量残留水分最终会在细胞内结冰。胞内冰晶的形成会扰乱细胞正常结构，具有破坏性且可能致其完全丧失功能。而减缓降温速率时，水向外渗出时间充足，胞内残留水份更少，冰晶生成减少。但同时，长时间高盐溶液暴露会导致细胞受损。

2）细胞解冻复温速率快慢影响胞内冰晶再结晶程度

       过冷环境下升温时，胞内有再次形成冰晶的时间窗口。缓慢升温时，细胞内部、胞外溶液从冰点以下上升到并平衡熔点过程长，冰晶形成时间窗口长，更有利于冰晶形成。相反，复温速度快则冰晶形成时间窗口缩短，抑制冰晶大量生成。

       因此，对于快速冷冻处理的细胞，复温速率过慢所导致冰晶再结晶( recrystallization)对细胞更具破坏性，会比缓慢冷却后快速复温的细胞受损更严重。换句话说，细胞解冻过程的复温速率是越高越好。根据这一原理，人们在大型冷冻保存组织复温中引入新型射频超快速金属模具加热复温技术（2000℃/分钟）获得成功 ^[11] 。

3）中等冷却速率的确定和适用范围

       综合降温冷却及解冻复温两个阶段盐分、冰晶生成之间的密不可分，只有采用中等冷却速率能保护细胞免受两种损害因素的影响，从而实现细胞保存后的最高存活率。中等冷却速率原则不仅适用于酵母菌等，也适用于哺乳动物细胞。中等冷却速率是一个大致范围，而非一个绝对值，因细胞类型和溶液组分不同而又差别。譬如，在含1.5M DMSO的保存液中，冷冻绵羊胚胎的冷却速率0.3℃/min ^[21] 。而肝细胞三维球体则以0.1、0.2及0.3℃/min速率冷却处理均表现出可重复的解冻后高恢复率 ^[22] 。不过，对于膜通透性较高的细胞类型（如红细胞和精子细胞），在10℃/min或更高速率下冷却时可达到最佳解冻后存活率，实现细胞存活所需的冷冻脱水与毒性规避的关键平衡 ^[23] 。需注意，无论是马祖尔时代抑或当下，不少实验人员或许听说过细胞冷保存最佳冷却速率应为1℃/分钟的提法。其实，这有悖于马祖尔中等冷却速率指导思想。

       无论是卢耶特的玻璃化技术，还是马祖尔的“缓慢冷冻保存法”，目的都是为了解决低温保存方法中细胞内部冰晶的形成和生长这一顽疾。马祖尔指出，当冰晶体积达到细胞内部空间容积的16%，就会导致卵母细胞的死亡 ^[18] 。法伊等发现，细胞内部结构被冰晶机械作用破坏是导致肾脏等哺乳动物器官功能丧失的主要原因 ^[16] 。因此可以说，包括卢耶特、马祖尔、法伊在内的整个科学界，对于细胞内冰晶形成损伤是导致细胞活力丧失的主要原因的这一观点，基本上已形成共识。

1.2 冷冻保存相关延迟性细胞死亡说

       冷冻保存细胞复苏后细胞死亡的蛛丝马迹，见诸于大量细胞实验报告之中，可以说这是细胞培养实验的常见现象。

       譬如，永生化的人T淋巴细胞系Jurkat细胞，通过程控降温仪分别缓慢冷冻至-50℃的溶液玻璃化转变温度、-40℃非玻璃化温度后，再各自转移到液氮环境下保存。解冻后将各样本细胞初始密度统一调整为7.5±10⁴个细胞/孔，培养24-48-72小时后进行的存活率和代谢活性检测。结果显示，-50℃玻璃化处理的细胞解冻24小时后活性细胞数为8.8±10⁴个细胞/孔，72小时后活性细胞数升至13.1±10⁴个细胞/孔。-40℃非玻璃化处理样品中，解冻24小时后活性细胞数为4.5±10⁷个细胞/孔，48小时后已活性细胞数为4.2±10⁷个细胞/孔，培养72小时内未出现增殖现象。-50℃转移的样本在解冻后48小时和72小时的存活细胞数量、代谢活性值均显著高于非玻璃化处理样品 ^[24] 。结果表明，悬浮培养的Jurkat细胞因胞内结冰损伤，存在解冻后的前24-72小时课出现持续地、大量细胞减损的事实。

       但有研究证明，对于融合单层细胞膜，细胞内冰形成（intracellular ice formation, IIF)不仅是无害的，甚至一定程度上对细胞具有保护作用。发生IIF情况下，V-79W中国仓鼠成纤维细胞、MDCK细胞培养的单层贴壁细胞或融合单层解冻后细胞存活率有差异：对于单层贴壁细胞，IIF发生导致解冻后的细胞恢复能力有所降低，但存活率依然处于较高水平；而融合单层细胞，则完全免于IIF伤害，甚至在冷却至-40℃时仍表现出高存活率。分析指出，若低温缓慢冷却损伤是源于冷冻与解冻过程中细胞体积的剧烈变化，那细胞内适度的冰晶生成，将有利于消除细胞渗透压失衡，阻止冷却过程中水分子通过质膜外流，反而发挥保护融合单层细胞免受缓慢冷却过程中的IIF损伤的作用 ^[25] 。

       类似研究也显示，IIF会对猪角膜内皮细胞（porcine corneal endothelial cells, PCEC）的单层细胞膜造成即时胞膜损伤，但却在解冻培养24小时后膜性维持完好。同样是IIF，人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）的单层细胞膜却未观察到即时性损害，但在解冻后 24 小时的培养期间发生膜的延迟损伤 ^[26] 。这一方面证实HUVEC 和 PCEC细胞单层对IIF的反应异质性，另外也验证了IIF对细胞损伤效应存在时间滞后性的现象。

       在采用标准冷冻保存条件下hES细胞团进行冻融处理后显示，解冻后清洗（5分钟时间点）后，贴壁培养的hES细胞中98%保持活性。然而，当hES细胞团转入37℃恒温箱培养时，细胞活力会随培养时间增加而下降。这种细胞群存活率的急剧下降可被转移到4℃环境下遏制，但再次当恢复至生理温度37℃时，细胞存活率再次呈时间依赖性下降。分析指出，如果hES在冷冻保存期间的死亡是IIF和渗透休克导致，那么细胞膜物理完整性会立即丧失后，可通过台盼蓝染色法可以检测到。这表明，冷冻复苏细胞培养期间出现的细胞活性下降，并非因IIF对细胞结构物理损伤引起 [8] 。

解冻复苏时镜下细胞结构保持完整性的细胞，正常培养期的前72小时内出现的大量坏死的现象，研究人员称之为延迟性细胞死亡（delayed-onset cell death） ^[27]或冷冻保存诱导的延迟性细胞死亡（cryopreservation-induced delayed-onset cell death, CIDOCD） ^[28] 。

       大量实验报告中，都可找到冷冻保存细胞的延迟性细胞死亡的痕迹，只不过是细胞死亡比率高低不同或死亡率处于实验设计可接受范围。说明这一现象具有一定普遍性。由于通常在复温后的前24-48小时内逐渐显现，很容易被忽视，造成人们对特定实验方法中细胞实际恢复率的高估。深入了解与冷冻保存诱导的分子细胞死亡相关的途径与机制，有针对性地开发出可降低延迟性细胞死亡的细胞保存材料和优化冷冻保存策略，对冷冻保存后的细胞高回收率具有重要意义。

       纽约州立大学细胞和分子生物家兼BioLife生物技术公司创始人约翰•M•鲍斯特（John M. Baust），从1998年开始关注延迟性细胞死亡现象。多种细胞死亡信号通路的激活往往需要在复苏并转入正常培养数小时至数天才陆续显现。细胞病理性坏死性（譬如，解冻后6小时）和基因程序性凋亡（解冻后12小时）具有明显延迟发作特征。而这一过程与细胞冷冻保存后死亡的时间特性相符。因此，鲍斯特指出，传统慢速冷却保存方法保存的MDCK细胞，在解冻后活细胞数量在最初24小时内持续下降，是由于延迟性坏死与凋亡性细胞死亡共同作用所致。解冻后立即出现的caspase活性初始升高（6小时）代表内源性前caspase的募集与激活过程，解冻21小时左右检测到的延迟峰值，是caspase依赖性凋亡信号放大导致转录和翻译水平上调的结果。通过在冷冻保存液加入caspase-1凋亡信号转导通路抑制剂，能降低延迟死亡，提升解冻后的细胞存活率 ^[27] ，验证了这一推测。研究显示，提高caspase-1凋亡信号通路抑制剂的浓度并不能额外提升存活率，而且单独添加caspase-1通路抑制剂并不能完全阻断冷冻保存后的细胞凋亡。分析，凋亡是由于冻融过程中存在多种内、外源凋亡激活通路诱导途径激活产生的。

       目前认为，在低温冷冻保存过程中细胞损害机制中，除了冰晶本身对细胞功能结构的机械物理损伤、溶液高渗透压（Hyperosomolality）应激外，还存在氧化应激、低温冻伤、CPA毒性等多种诱因。损伤部位包括细胞膜相变（Membrane Phase Transitions）、细胞骨架解体（Cytoskeletal Disassembly）、细胞核和线粒体等多种器质性损伤，受损生物分子涉及蛋白酶、脂质和核酸，细胞内部出现离子失衡、蛋白质变性（Protein Denaturation）、自由基生成等生物化学过程，以致于细胞能量代谢、发育、增殖等生物活动过程受扰，细胞最后以延迟性死亡形式表现出来 ^[29] 。

       现在看，这一过程所涉及的维度之广、机制之复杂，绝非可以用细胞凋亡信号通路激活理论就能全部概括。应该效仿卢耶特那样，借鉴物理化学定律，从低温保护剂、水分子化学属性与细胞结构与功能间的内在联系的角度来考察，似乎更容易接近真相。

 （待续）